蛋白质活性测定方法

核糖核酸酶（RNase）的活性测定（1）溶液的配制：①0.1mol/LpH5.0的乙酸缓冲溶液：称取5.78gCH3COONa,加入1.7mLCH3COOH,用蒸馏水稀释至500mL。②0.05%RNase酵母溶液：称0.05gRNase酵母，用0.1mol/LpH5.0的乙酸缓冲溶液溶解并稀释至100mL。测活方法：（2）用移液管移取已配制好的0.05%的核糖核酸酵母溶液2.5ml于比色皿中，加入一定量的样品RNaseA溶液，迅速摇匀，以蒸馏水为参比，在300nm波长下每隔30秒测一次吸光值，共读3分钟，得到一组对应于时间t(min)的At值。当样品管反应3小时后再测定300nm处的吸光值Af,Af为最终的光吸收，分别求得一组对应于t的log(At-Af),以log(At-Af)对时间t作图应得到线性关系，画出直线。求出直线斜率的数值S，将S带入标准曲线，求得活性回收率。将S带入下列公式中，可求出酶的活力。单位/mg=S×(-2.3)×4/(样品管中含酶的数量)胰凝乳蛋白酶（α-Chy）活性测定用胡梅尔(Hummel)法测定α-胰凝乳蛋白酶[2]：(1)原理：α-胰凝乳蛋白酶优先催化水解结合有氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的L-异构体）的肽键。我们可以通过在256nm处测定吸光度增大值的办法来测定反应的速度。苯甲酰-L-酪氨酸乙酯的水解反应引起吸光度的增大。(2)定义：一个凝乳蛋白酶单位相当于在pH值为7.8，温度为25℃时，每分钟水解1μmol苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)所需的酶量。(3)试剂配置方法：Tris缓冲液(pH:7.8)取0.969g三（羟甲基）氨基甲烷和1.47mg二水氯化钙溶于80mL蒸馏水中，用1N的盐酸将pH值调至7.8，并定容至100mL。①盐酸(HCl):0.001moL/L②酶溶液：先用盐酸溶解酶，使溶液浓度达到1mg/mL，然后再用盐酸稀释，使最终浓度达到0.5～1.0U/mL。③底物溶液：取33.5mg苯甲酰-L-酪氨酸乙酯溶于50%的甲醇(63mL甲醇与50mL蒸馏水混合)，定容至100mL。（4）操作步骤：用移液管将1.5mLTris缓冲液和1.4mL底物溶液滴入一只1cm比色皿，并加热至25℃，加0.10mL酶溶液，摇匀。用分光光度计(256nm)测定反应混合物的吸光度，在约5.0min内每隔1.0min读取吸光度一次，直到每分钟吸光度的增大值达到稳定为止。（5）计算用以下公式计算酶的活性：U/mg3E0.964Ew256式中：Ｅ256—在256nm处测得的每分钟内吸光度的增大值Ｅw—每0.10mL所用酶液中含酶的重量(mg)0.964—1μmolBTEE的吸光度(256nm处)3—反应液的总体积胰蛋白酶（Trypsin）的活性测定用施韦尔特-竹中（Schwert&Takenaka）法测定胰蛋白酶[3]：(1)原理：胰蛋白酶将N-苯酰基-L-精氨酸从BAEE中释放出来，用分光光度计于253nm处跟踪测定由该反应引起的吸光度增大情况。(2)定义：一个胰蛋白酶单位相当于在规定条件下每分钟使吸光度增大0.001时所需的酶量。(3)试剂配置方法：①底物溶液：取30.9mgBAEE，280mg二水氯化钙和566mg三羟甲基甲烷溶于70mL蒸馏水中，将pH值调至7.6。定容至100mL。②盐酸（HCl）：0.001mol/L③酶溶液：酶用0.001N盐酸溶解。1.0mL配制酶溶液中应含有150U左右。(4)操作步骤：用移液管将2.8mL底物溶液滴入1cm比色皿，调温至25℃。添加0.20mL酶溶液，混合。用分光光度计于253nm处以蒸馏水为参比测定吸光度，直至每分钟吸光度增大值达到恒定为止。(5)计算：用以下公式计算活性:U/mgE0.001Ew253式中Ｅ253—每分钟内253nm处吸光度的增大值0.001—一个酶单位每分钟使吸光度增大0.001Ew—0.2mL所用的酶溶液中含酶的重量(mg)Lys活性的测定取溶壁球菌干菌粉少许，加入少量0.067mol/L的磷酸缓冲液(pH=6.2)，用玻璃棒研磨匀浆，再加入磷酸缓冲液至OD值为0.6-0.8即可。用移液管移取3.0mL配置好的溶壁球菌菌液于比色皿中，加入一定量的Lys溶液(酶量在100ug左右)，迅速摇匀，以蒸馏水为参比，在450nm的波长下每隔30秒测一次吸光值，共读3分钟，以吸光度对时间作图，取最初线性部分，其斜率即为吸光度值的变化率。在以吸光度值的变化率对加入标准蛋白的质量作图，用同样的方法测定样品的吸光度值的变化率，依据标准曲线求得蛋白的绝对量或浓度，与同时对照的标准蛋白活性绝对值或浓度比较，便可计算出活性回收率。中国生物制品标准化委员会编.中国生物制品规程[M].北京:化学工业出版社,α-Amy活性的测定（1）溶液的配制：①0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.0）：称取1.8g磷酸氢二钠和1.0g磷酸二氢钾，用水溶解后定容至1L。②0.1%淀粉溶液：称取100mg可溶性淀粉与50mL烧杯中，加少量蒸馏水制成糊状，然后转移到盛有80mL0.01mol/L氢氧化钠的150mL烧杯中煮沸，冷却后倾入100mL容量瓶中，用0.01mol/L氢氧化钠稀释至刻度。③0.005mol/L碘液:称取3g碘化钾和1.3g碘用水溶解后，稀释至0.05mol/L碘液，然后再稀释10倍。④标准酶液：准确称取1.0mg高纯度α-Amy于离心管中，加入1mL水，溶解后，于12000RPM离心5分钟，上清液转移到另一离心管中备用。用时稀释100倍。（2）活性测定取7支比色管，用移液管准确加入3.0mL0.1%淀粉溶液，5.0mL磷酸缓冲液，然后分别加入稀释标准酶液0.0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6mL，在37度温热15分钟后取出立即冷却，于每个比色管中各加入0.4mL0.005mol/L碘液，用水稀释至刻度，摇匀，以蒸馏水为参比，在波长580nm条件下，用分光光度计测量吸光度，在一定范围内，吸光度减弱的程度与酶活力大小成比例。