蛋白质组学在水果品质控制方面的应用进展

1蛋白质组学技术在水果品质控制方面的应用进展摘要：蛋白质组学旨在阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。其对生命现象的诠释直接、准确，已逐渐成为现代生物技术发展的支撑技术。近年来，蛋白质组学在食品科学方面的应用逐渐涉及各个方面，包括果实保鲜研究、食品功能研究、食品营养分析、食品品质评价、安全检测及真伪鉴别等。这为与食品科学相关的研究提供新思路和新技术。本文概述了蛋白质组学的概念及相关主要研究技术，分析了蛋白质组学在食品科学研究中的应用，尤其水果品质控制方面，并对其在食品加工检测方向的发展前景进行了展望。关键词：蛋白质组学；电泳技术；质谱技术；水果；品质控制TheapplicationprogressofproteomicstechnologyinfruitqualitycontrolAbstract:Proteomicsseekstoclarifythegenomeexpressionreallyperformlifeactivitiesproteinexpressionpatternandbiologicalfunctions.Directinterpretationofthephenomenonoflife,accurate,andhasgraduallybecomethesupportofthedevelopmentofmodernbiotechnologytechniques.Inrecentyears,theapplicationofproteomicsinfoodsciencegraduallyinvolveallaspects,includingfreshfruitresearch,functionalfood,foodnutritionanalysis,evaluationoffoodquality,safetytesting,andtheauthenticityofidentification.ThisistoprovidenewideasandnewtechnologyresearchandFoodScience.Thisarticleprovidesanoverviewoftheconceptofproteomicsandrelatedresearch,analysisandapplicationofproteomicsinfoodscience,especiallyfruitqualitycontrolaspectsandprospectsofitsdevelopmentinthedirectionoffoodprocessingdetectionprospect.Keywords:proteomics;electrophoresis;massspectrometry;fruit;qualitycontrol前言1994年澳大利亚科学家MarcWilkins提出蛋白质组概念，并在1995年7月在《Electrophoresis》生命科学领域从那开始取得了许多突破性的进展。特别是2003年人类基因组计划完成，功能基因组时代到来，蛋白质组学的研究被提升到新的高度[1]。全基因组测序工程为世界各物种基因组学的研究奠定了重要的信息基础，也为蛋白质组学的研究提供分析基础。植物基因组尤其是水果类基因组相对庞大，测序工作进展缓慢。目前，已测序完成的水果物种有：番木瓜Caricapapaya(Papaya)，西瓜Citrulluslanatus(Thunb.)(Watermelon)，甜橙Citrussinensis(Sweetorange)，甜瓜Cucumismelo(Melon)，黄瓜Cucumissativus(Cucumber)，草莓Woodlandstrawberry(Fragariavesca)，苹果Malus×domestica(Domesticatedapple)，木薯Manihotesculenta(Cassava)，香蕉Musaacuminata(Banana)，桃2Prunuspersica(Peach)，番茄Solanumlycopersicum(Tomato)，葡萄Vitisvinifera(WineGrape)。蛋白质组学作为一项较为新兴的技术，以蛋白质组为研究对象，在蛋白质水平上，整体，定量，动态地去研究和分析正在工作的基因组，是后基因组时代的一个重要组成部分[2,3]。蛋白质组学主要对蛋白质表达进行研究分析，研究工具以分离技术和生物质谱技术为支撑平台，生物信息学为桥梁。蛋白质赋予食品功能性及营养性等特性，是食品重要组成成分之一。蛋白质是生物体细胞的重要组成成分，在细胞的结构和功能中发挥重要作用。为了保证食品蛋白组分的生化活性达到最高期待值，对食品的生产，包括原料养殖（种植）、收获、加工、保藏等环节的控制都需有严格的要求。因此，在食品生产及最终产品质量控制上，需进行必要的蛋白质检验。蛋白质组学技术在食品蛋白质研究中应用越来越广泛。在功能性食品或者高附加值食品的真伪鉴别和品质控制中，蛋白质组学相关技术对蛋白质组分进行分析，获得本质的产品信息。与传统的检测方法相比优势明显，且为食品功能研究、营养分析、安全监测、品质控制与评价、新型食品开发等研究领域提供新方法。本文综述了蛋白质组学的主要研究技术及在食品方面的应用进展，重点论述其在水果品质控制与分析，并对其在食品安全监测方面的应用进行展望。1蛋白质组学蛋白质组(proteomics)是一个基因组所表达的全部蛋白质[4]，即生物物种、个体、器官、组织、细胞乃至体液等在特定的环境条件、特定的时刻全部蛋白质表达的图谱。概括来讲，蛋白质组学是基于蛋白质组的对大量蛋白质的整体研究，包括在生长发育中和各种外界因素下的蛋白质结构、功能和丰度的变化等[5]。同时，蛋白质组学是基因组学与代谢组学之间联系的桥梁，蛋白质组学的研究旨在阐明组织、器官或生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，揭示特定生命现象和过程的机理。蛋白质组学技术具有的高通量、高精确度等特点，为植物的生长发育、成花机理、胁迫反应、生理处理等内在机理的研究在蛋白质水平上提供了新的研究途径[1]。蛋白质组学研究的主要技术有：蛋白质组分分离技术，蛋白质组分鉴别技术及利用蛋白质信息学对蛋白质结构、功能进行分析和预测。目前蛋白质分离分析技术主要有四种较为常用，分别为：电泳技术、质谱技术、色谱技术及蛋白质芯片技术。蛋白质组学的三大核心技术分别是双向电泳技术、质谱技术和生物信息学[6]。其中，双向电泳技术和质谱相结合的方法是目前较为经典且应用广泛的技术[7]。2蛋白质组学关键技术2.1蛋白质样品的提取制备蛋白质样品的提取及制备技术是蛋白质组学研究的基础和关键。理想的蛋白质提取方法3能够获得大量蛋白、最大程度降低蛋白污染和防止蛋白变性和降解并具有可重复性，有助于获得高质量2-DE图谱和蛋白质相关信息后续研究[8]。蛋白样品制备是获得高质量且重复性好的2-DE凝胶图像的关键步骤。蛋白样品的提取的传统常用方法是TCA/丙酮法和酚抽法。但是，在大量的实验研究中，科学研究人员根据原材料的特殊组成常对着两种方法进行改良以获得最为适合自身研究材料的提取方法。不管采用哪种方法，在蛋白质样品制备过程中，应尽可能提高样品蛋白溶解度，抽提最大量总蛋白，减少蛋白损失，减少对蛋白的人为修饰，破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。TCA/丙酮沉淀法[9]和酚抽法[10]是植物蛋白质提取的基本且常见的方法。Isaacson等[11]对上述两种方法做了简要的说明及对比，认为TCA/丙酮法虽已成功运用于植物幼嫩组织蛋白的提取。但对复杂的顽拗植物组织，如：成熟葡萄果粒、马铃薯叶片、香蕉果实等，使用酚抽法比TCA/丙酮法获得更好的实验结果。采用酚抽法可以抑制蛋白酶的活性，避免蛋白质的降解，还可较好地避免酚类、多糖和色素等物质的干扰，得到的蛋白质干粉中杂质少。Vincent等[12]在进行葡萄果实蛋白质提取时也表明，酚抽提法虽操作复杂、耗时长，但能获得更多的蛋白点和高质量的双向电泳图谱。Vincent等还发现利用酚抽提法用尿素、硫脲素两种裂解剂再悬浮相结合的方法更适合葡萄蛋白的提取。同时，Wang等[13]在提取葡萄果实蛋白质组时采用了PVPP/TCA法，即将酚类化合物用酸化的PVPP（增加PVPP聚合能力和消除PVP的污染）多次洗脱后，再用TCA、丙酮沉淀蛋白，此方法耗时少、毒性小且2-DE图谱的质量会随PVPP洗脱次数的增加而提高，同时还适于葡萄果实中β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)的检测与分析。然而，植物细胞中包含多种次生代谢物质，可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化[14]，从而在果实组织中提取蛋白质难度增加。由于果实中蛋白质含量相对较低，并且含有大量干扰性物质，如色素、淀粉、多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等，对高纯度蛋白质的提取也有一定的难度[15]。水果果实蛋白质的提取分离与鉴定研究技术需要进一步探讨与优化。2.2蛋白质浓度的测定蛋白质浓度的测定用于衡量蛋白样品的提取量是否满足双向电泳及后续实验的需要。蛋白质浓度的测定常采用Gornall双缩脲[16]、Lowry酚试剂[17]、Bradford法[18]等比色定量的方法测定,其中Bradford法是应用最广的，很多试剂盒就是在它的基础上优化得来。Levashov等[19]发现Goa法不仅能够测定全蛋白浓度，还能对较难测定的寡肽、膜蛋白质等的浓度进行测定。并且Goa方法所获得校准曲线较稳定，灵敏度高，能够适合含量在0.1~1.2mg范围内蛋白质的测定，并且不用繁琐的稀释，较为方便。另外，Goa法还可检测1g/ml的多肽溶液。42.3电泳技术蛋白质组学研究中，主要的电泳技术是双向凝胶电泳(2-DE)，其他还有聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细吸管电泳(CE)等。SDS-PAGE曾是蛋白质分析较为常用的方法，此法具有特异性强、操作简单及干扰因素少等优点，可用于检测蛋白质纯度、评估蛋白质分子质量等。但是这种方法只能将不同分子质量的蛋白分离，对于分子质量相同的蛋白则无法分离[20]。毛细管电泳(CE)是一种新兴的色谱分离技术，这种技术是将经典电泳技术与现代微柱分离有机结合[21]。目前，该技术已广泛应用于蛋白质的高效分离分析。与经典电泳相比，毛细血管电泳由于其侧面积/截面积大、能克服由于焦耳热引起的谱带展宽、散热快、可承受高电压，其分离效率较高[22]。此外毛细血管电泳还具有灵敏度高、样品需求少、速度快、种类多、分离范围广、成本低等诸多优点。但是其对于复杂样品的分离尚且不完全。2.3.1双向电泳技术双向电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)由O′Farrell于1975年创立的，作为蛋白质组研究的核心技术之一，是目前常用的唯一能连续在一块胶上分离某一物种的数千种蛋白质的方法，同时是当前分辨率较高的工具，已在生物学研究方面得到广泛的[23]。双向电泳根据蛋白质两个相互独立的特性等电点和分子量对蛋白质组分进行两次电泳：第一向等电聚焦(Isoelectrofocusing,IEF)，IEF是基于蛋白质等电点不同而将其分离；第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，是基于蛋白质亚基分子质量不同而分离，从而达到在二维空间上先后将蛋白质分离的目的，并能得到蛋白质等电点和分子量的信息。两次电泳后会在二维胶上出现浓度不等的点，一个点通常代表一种蛋白质。电泳之后的染色主要有考马斯亮蓝染色法和银染法、负染、荧光染色法等。但二维电泳技术对低拷贝、强疏水性、低溶解度、极酸或极碱的蛋白质不易分离，同时也存在繁琐、灵敏度低、不稳定等缺点[24]。实验过程中，影响双向电泳图谱效果的因素有多方面。在进行苜蓿、水稻及一些盐生植物[25-27]等的生物学研究中，不同的蛋白提取方法、不同分离胶浓度、不同等电聚焦(IEF)电泳上样量、不同pH范