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山西农业大学实验报告单实验名称:考马斯亮蓝(Bradford)法测定蛋白质含量班级:生信1301班学号:姓名:实验日期:2015年7月11日一、实验目的:1)了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理;2)掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤。二、实验原理:考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合,使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。三、仪器和试剂:1、试剂:1)标准蛋白质溶液,用牛血清白蛋白(BSA),配制成1.00mg/mL的标准蛋白质溶液(称取100mg结晶牛血清白蛋白,溶于100mLddH2O中)。2)考马斯亮蓝G-250染料试剂:称100mg考马斯亮蓝,溶于50ml95%的乙醇后,再加入100ml85%的磷酸,用水稀释至1L。(终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250,4.7%乙醇,8.5%磷酸)注:用磷酸调整溶液土褐色,蓝色不能用。2、仪器:分光光度计(Eppendorf,BioPhotometerplus)四、实验步骤:1)取7支试管,1支作空白,其余试管按表中顺序,分别加入标准蛋白、去离子水和考马斯亮蓝染料,即用1.0mg/mL的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用ddH2O补充到0.1mL。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G-250试剂,每支试管加完后,立即在漩涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见表2中的第1、2、3、4管。2)加完染料2-5分钟后,使用分光光度计,在595nm处测量吸光值A595。空白对照为第1号试管,即0.1mLH2O加5.0mlG-250试剂。3)用标准蛋白浓度(mg/mL)为横坐标,用A595为纵坐标,进行直线拟合,得到标准曲线。根据测得的未知样品的A595,代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。五、实验结果:根据表1,以A595为纵坐标,标准蛋白质量/(μg)为横坐标,作图(相关系数)。根据线性拟合公式y=ax+b计算所测溶液的蛋白质的含量。1)标准品实验数据如表1所示:表1标准品测定实验表格管号试剂(mL)123456标准蛋白质(1.00mg/ml)00.010.020.040.060.08ddH2O0.10.090.080.060.040.02考马斯亮蓝G-250试剂5.05.05.05.05.05.0对应的吸光度A595每管中的蛋白质量(g)010204060802)标准曲线如下图所示:3)实验样品数据如表2所示:表2样品测定实验表格管号试剂(mL)12未知蛋白质00.04ddH2O0.10.06考马斯亮蓝G-250试剂5.05.0对应的吸光度A5950.000每管中的蛋白质量(g)0六、操作注意事项:1)不可使用石英比色皿,可用塑料或者玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可以用乙醇或丙酮长时间浸泡。2)微量法测定:当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100g/mL),可将取样量(包括补加的水)加大到0.5mL或1.0mL,空白对照则分别为0.5mL或1.0mLH2O,考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0mL,同时作相应的标准曲线,测定595nm的光吸收值。
本文标题:蛋白质组学实验二(模板)
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