蛋白质组学研究技术进展.

差异蛋白质组学的研究技术研究生：主要内容•蛋白质组学研究背景•1、双向凝胶电泳技术•2、双向差异凝胶电泳技术•3、同位素亲和标签技术•4、同位素标记相对和绝对定量技术（重点）蛋白质组学背景•随着人类基因组计划的完成和对基因组研究的深入，人们认识到单纯依靠基因组信息并不可能完全揭示生命的奥秘。这是因为蛋白质才是生物功能的体现者，所以必需考虑基因编码的蛋白质具有什么功能。•不仅如此，基因在转录和翻译过程中存在转录和翻译水平的调控,蛋白质往往还要经过剪接、修饰、加工之后，最终才能成为有功能的蛋白质；而且生物体不同组织、不同分化程度和在不同环境下，所表达的蛋白质是不同的，所以单纯从基因组水平上并不能完全揭示生命活动的规律。在这种背景下，蛋白质组学应运而生。•1994年，MarcWilkim在Siena双向凝胶电泳(two—dimen．sionalelectrophoresis，2-DE)会议上最早提出了蛋白质组(proteome)概念，并于1995年7月的Electrophoresis(电泳)杂志上发表。•蛋白质组学是以生物体的全部或部分蛋白为研究对象，研究它们在生命活动过程中的作用、功能。蛋白质组学较之前的基因组学对于生命现象的解释更直接、更准确。蛋白质对生命活动的直接作用比基因复杂得多．对于某一种生物或有机体来说，基因组是唯一的，而蛋白质组随细胞的种类、功能、生理状态、环境条件和病理状态而不断变化，因此仅仅从基因的角度来研究是不够的。•随着对蛋白质组学的深入理解和具体工作的开展，人们逐渐认识到在短时间内建立蛋白质组学“完整的”数据库和实现网络资源共享是难以实现的，因为条件尚未成熟。于是结构蛋白质组学研究着重于寻找和筛选任何有意义的因素引起的2个样本之间的差异蛋白质谱，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质、对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，因此，差异蛋白质组学研究技术应运而生。1、双向凝胶电泳技术•1975年,意大利生化学家O’Farrell（奥法雷尔）发明了双向电泳(two—dimensionalgeleldctropgoresis，2-DE)技术。该技术应用两个不同分离原理为依据进行分离，即利用蛋白质分子的等电点(PI)和相对分子量的不同进行分离．第一向电泳是蛋白质的等电聚焦，根据蛋白质等电点差异进行分离，该分离技术采用固定pH梯度技术(IPG)可以实现等电点只差0．01pH单位的蛋白质的分离；第二向电泳是利用蛋白质相对分子量差异进行分离，可分离相对分子量在100×103～150×103的蛋白质。•例如：番茄种子空间搭载与地面后代叶片的差异蛋白质组研究。CK-2是对照组，MIR-2是实验组。图1用不同裂解液裂解后的CK-2双向电泳图左图裂解液中的去垢剂用的是CHAPS,右图裂解液中的去垢剂是NP-40。图2对照样品CK以及和平号搭载样品MIR的双向电泳结果图•样品MIR-2和对照组CK-2的双向电泳结果进行了IMAGEMASTER软件分析,共找到了42个表达差异2倍以上的蛋白质点,对其中26个差异比较明显的蛋白质点进行了ESIQ-TOFMS/MS质谱分析,共鉴定出10个蛋白质点,鉴定的蛋白质在对照组均表现为上调,在空间站搭载样品中表现为下调。•2-DE的局限性:重复性差;自动化程度低,费时费力;对过大(100ku)和过小(10ku)的分子量的蛋白质、低丰度蛋白质(1000copies)、极酸或极碱和难溶的蛋白质如膜蛋白等分离困难。2、双向差异凝胶电泳技术•双向差异凝胶电泳(twodimensiondifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE)是一种新出现的荧光标记的定量蛋白质组学技术，比经典的2-DE具有更高的动力学范围和灵敏性。该方法通过引入内标使得多个样品在一块胶上分离，进而减少了实验条件不一致引起的误差。DIGE技术可检测到表达差异小于10％的蛋白，统计学可信度达到95％以上。•DIGE系统基于荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术，是利用电荷和分子量的差异分离蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的第二向SDS-PAGE凝胶图像。DIGE系统结合了新型荧光技术、样品多路技术(samplemultiplexing)和图像分析等特有的技术，是一套优于经典的2-DE的完整的系统。DIGE的试验流程AmershamPharmaciaBiotech,LifeScienceNews,7,2001•例如：曹晓艳等利用双向差异凝胶电泳技术和质谱检测技术在“新世纪”杏的小蕾期、大蕾期、自花授粉后24h、异花授粉24h后的花柱中共检测到1500个蛋白点，其中66个差异表达的蛋白点，证明“新世纪”杏花花柱对自体与异体花粉感应在蛋白质组水平上有差异。a小蕾期b大蕾期c自花授粉后24hd异花授粉后24h•DIGE技术与传统的2-DE方法相比,优点在于:重复性大大提高、蛋白质样品的差异表达更精确直观、动态范围更宽、染色时间短、荧光标记不会影响质谱分析结果。缺点是其标记方法只适用于含有赖氨酸的蛋白质;对于赖氨酸含量少的蛋白质的DIGE标记有一定的困难。因为只有一小部分蛋白质被标记,大部分蛋白质在Cy3、Cy5标记的谱图上看不到。3、同位素亲和标签技术•同位素亲和标记(isotope-codedaffinitytags,ICAT)技术最早由Gygi等提出。ICAT技术是利用一种新的化学试剂-同位素亲和标签试剂预先选择性地标记某一类蛋白质,分离纯化后,质谱(massspectrometry,MS)鉴定。并根据质谱图上不同ICAT试剂标记的一对肽段离子的强度比例,定量分析它的母体蛋白质在原来细胞中的相对丰度。•ICAT试剂由三部分组成。①试剂与蛋白质反应的基团,这个基团特异结合肽链中半胱氨酸残基的巯基;②中间的连接子,可以结合稳定的同位素;③亲和标签-生物素(Biotin),可以和卵白素结合,选择分离ICAT标记的多肽。试剂分为两种形式,分别称之为“重”(连接子含有8个氘原子)和“轻”(连接子含有8个氢原子);由8个氘原子与8个氢原子分别标记的ICAT质量正好相差8Da。•ICAT技术的具体操作流程是:•①两种来源密切相关而不同状态的细胞裂解,蛋白质被还原;•②两种样品中各加入不同的ICAT试剂标记;•③标记完全后的两种样品混合,胰酶水解成大小不同的肽段;•④固相阳离子柱交换,除去所有残留的胰酶、去垢剂、还原剂和ICAT试剂;•⑤标记与未标记的肽段经卵白素亲和层析分离;•⑥标记的肽段洗脱后经液相色谱(liquidchromatography,LC)再次分离,串联质谱(tandemmassspectrometry,MS/MS)分析,通过比较峰型完全一样的一对肽段峰的离子强度,可以推断出两种样品中同一种蛋白的相对含量,再将质谱检测数据提交数据库检索,鉴定相对应的蛋白质。•Han等通过乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)诱导人类骨髓白血病细胞(HL-60)的细胞表面蛋白的分化,使用ICAT试剂标记分化的蛋白,鉴定了未诱导的和诱导的HL-60细胞的491种蛋白的丰度比。•Hardwidge等通过ICAT结合电喷雾离子化串联MS方法首次大规模地分析人类细胞对病原体肠致病性大肠杆菌(EPEC)的反应,他们在Caco-2单细胞层中分离并鉴定了超过2000种单一蛋白,其中13%与EPEC引起的腹泻相关。•与双向电泳技术相比,ICAT技术有如下优点:①因为分离在肽段水平上进行,可以对膜蛋白进行鉴定和定量;②通过选择标记含半胱氨酸肽段,降低了蛋白质混合物的复杂性③比较两种或更多种来源密切相关的蛋白质样品,可以得到不同状态下蛋白表达量的变化比例。④对于含有多个半胱氨酸残基的蛋白质,通过重复检索含多半胱氨酸的肽段可得到肯定的鉴定和定量;⑤因为ICAT技术建立在色谱分离的基础上,任何促进蛋白质溶解的试剂均可使用;⑥能够直接鉴定和测量低丰度蛋白质。•其最大的缺点是蛋白质序列中必须含有半胱氨酸，那些在功能上有重要作用但不含半胱氨酸的蛋白质将会被遗失。4、同位素标记相对和绝对定量技术•由美国应用生物系统公司(AppliedBiosystemsIncorporation，ABI)开发的同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技术是一种新的、功能强大的可同时对四种或八种样品进行相对或绝对定量研究的方法。•iTRAQ试剂由三个部分组成：•第一部分为肽段反应基团，由于它活跃的化学性质，在弱碱性条件下可以迅速和伯胺基团反应，也就是和肽段的氨基端以及赖氨酸的ε氨基发生共价化学反应，从而使得每个肽段都带上标记。•第二部分为报告基团，它是由一系列C、N、O的稳定同位素组合而成的分子量相隔1Da的小分子，在iTRAQ4-plex中，包含114、115、116、117Da四种报告基团；在iTRAQ8-plex中，包括从113至121Da八种不同分子量的报告基团，由于苯丙氨酸的immoniumion分子量为120Da，所以分子量为120Da的报告离子没有被采用。ReportergroupMass:114to117PeptideReactiveGroupIsobaricTag:TotalMass=145BalancegroupMass:31to28PRG第三部分为平衡中性基团，平衡基团主要消除报告基团所引入的质量差异，因此不同标记试剂的平衡基团分子量也相对应发生变化，使得平衡基团和报告基团的质量之和最终为一个定值，这样在质谱检测的一级谱图上就观察不到质量偏差.•由于iTRAQ试剂是由一系列C、N、O的稳定同位素组合而成，其基本分子结构没有发生变化，不同标记试剂标记的相同肽段在物理化学特性上没有差异，因而其色谱保留时间和质谱离子化效率也基本一致，从而保证经不同标记试剂标记后的相同肽段能同时进行质谱分析。iTRAQ试剂标记好的多肽在进行一级质谱分析时不发生断裂，在二级质谱检测前进行碰撞诱导解离，此时iTRAQ试剂的报告基团和平衡基团发生断裂，产生的报告基团用于后续的定量分析，平衡基团由于中性丢失无法被检测，反应基团则仍偶联在肽段的N端。•等量不同来源的蛋白样品（一般每个样品100ug）经过还原烷基化、胰酶消化成肽段后，分别用带有不同大小报告基团的iTRAQ试剂进行标记。待标记反应完全之后，将不同报告基团标记的肽段等量混合，利用多维液相色谱对混合肽段进行分离，最终进入质谱进行定性和定量分析。由于标记的肽段的理化性质基本一致，因此不同样品来源的同一肽段将被同时洗脱和离子化。实验流程•在进行一级质谱检测时，不同报告基团标记的同一肽段的分子量一致，在谱图中叠加成一个峰，从而便于质谱仪进行母离子选择。在进入二级质谱检测时，母离子碎裂成一系列的碎片离子及报告离子，碎片离子则可以用于肽段的序列鉴定，产生的报告离子则可用于蛋白的定量分析，通过比较不同分子量大小的报告离子质谱峰强度来对不同样品来源的肽段进行定量比较。苹果酸脱氢酶•四分体：C1S1•单核期：C2S2•二核期：C3S3•7.21华大差异蛋白结果.xls可育不育•在本实验室做的关于BNS不育系与转换系的花药差异蛋白的研究中，用2-DE做出来的结果是：在单核靠边期-二核期，分离出来的差异蛋白为14个；而用iTRAQ做出来的结果为：单核期的差异蛋白为85个，二核期的差异蛋白为84个。而且，iTRAQ可以比较四分体-二核生长过程中的蛋白质的变化。2-DE与iTRAQ结果的比较•1、通量高，能够同时对多达8组的样品进行定量比较，大大降低了实验过程中所引入的技术误差。•2、覆盖率高，iTRAQ试剂与肽段的氨基端或多肽赖氨酸残基上的氨基基团发生共价反应，几乎所有的肽段都能被标记用于定量分析，使得定量的结果更为准确。•3、标记效率高，体外进行，反应迅速，98%肽段在30分钟内都能被标记。优点•4、定量技术准确度高，iTRAQ是基于质谱二级谱图进行蛋白质同时进行定性和定量分析，产生的报告离子位于质谱