第11章基因工程-PowerPoint演示文稿

第11章基因工程第1节基因工程概述第2节基因的分离第3节外源基因导入受体第4节转基因生物的检测与鉴定第5节基因工程的应用遗传工程（geneticengineering），也称生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。核心是利用重组DNA技术，在分子水平上操作修饰改变生物体。细胞工程（cellengineering）基因工程（geneengineering）酶工程（enzymeengineering）发酵工程（fermentationengineering）第1节基因工程概述基因工程（geneengineering）利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。基因工程操作的对象是DNA分子，首先把目标基因克隆出来插入到一定的载体中，然后将重组DNA分子导入到受体细胞，并使其保持和遗传下去。第1节基因工程概述目的基因的获目的基因与载体的连接成重组DNA分子重组DNA分子导入受体细胞筛选重组克隆基因表达与产物分离基因工程的内容第1节基因工程概述第2节基因的分离一工具酶二载体三基因分离方法第2节基因的分离一、工具酶（一）限制性内切核酸酶(restrictionenzymes)限制性内切核酸酶（限制酶）是细菌中降解外来DNA分子的一类酶。细菌中限制—修饰现象：作用于同一DNA的两种酶——分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。通过某些碱基进行甲基化修饰，使得限制酶不能进行切割。而外来的DNA在没有被甲基化，限制酶将其降解。（一）限制性内切核酸酶★共同的特性：只切割双链DNA分子，不切单链DNA；每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性；需要镁离子激活等。★限制酶可分为3类。Ⅰ型酶：只有EcoB和EcoK两种，具有催化限制性切割和修饰核苷酸2种功能。Ⅱ型酶：在遗传工程中应用最广泛。①有特异识别和切割的序列部位，被切割的DNA分子形成单链的断裂；②断裂的部位通常不是直接相对的，结果所形成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端），使其能够重新连接；③内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成。Ⅲ型酶具有特异的识别位点，这种识别位点是非对称的。（一）限制性内切核酸酶（一）限制性内切核酸酶通过用相同的限制性内切核酸酶切割形成一个重组DNA分子（一）限制性内切核酸酶（二）DNA连接酶（ligase）在分子克隆中使用的DNA连接酶有两种：大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶。催化DNA中相邻的3’–OH和5’–磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来。（三）反转录酶（reversetranscriptase）★反转录酶是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，所以又称为依赖于RNA的DNA聚合酶。★反转录酶在遗传工程中的主要用途是以mRNA为模板合成cDNA。（四）PCR◆聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是体外快速扩增DNA的方法。◆PCR反应包括三个步骤：●变性：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链。●复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-60℃●延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互补链◆这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环。◆PCR.EXE（四）PCRPCR产物可以通过电泳检测琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳二载体载体（vector）是将外源基因送入受体细胞的工具。作为载体DNA分子，需要具备：在宿主细胞中能独立复制，有独立的复制起始位点；载体DNA分子中有一段不影响其复制的非必需区域，即有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增；有选择标记，便于选择含重组DNA分子的寄主细胞；分子量小，多拷贝，易于操作。除了上述特点外，一般还要求载体载荷外源DNA的幅度要宽，具有安全性等。（一）质粒◆质粒(plasmid)是细菌染色体外存在的一种能够自我复制的双链闭合环状DNA分子，大小1kb～200kb。质粒常常带有一些特殊的基因，如致死基因，抗抗生素的基因等等。一般质粒都含有一个复制起始区，可独立复制。质粒DNA复制与宿主之间的关系，可分为“严谨型”和“松弛型”。“严谨型”质粒在每个细胞中的拷贝数通常1~3个，而“松弛型”通常在10个以上，可高达200个拷贝。◆一般质粒通过改造后才能用于遗传工程。（一）质粒pUC18可以克隆比较大的DNA片段，在细胞中产生500个拷贝左右。有一个多克隆位点，位于大肠杆菌的lacZ基因之内，有利于筛选和分离转化细胞。筛选的原理是：细菌细胞含有野生质粒，在含有X-gal（5-溴-氯吲哚-半乳糖苷酶）的培养基上培养时产生兰色菌斑；插入克隆片段后，lacZ基因失去功能，不能代谢X-gal，从而产生白色菌斑。（一）质粒（二）病毒载体◆λ噬菌体基因组全长48kb。具有粘性末端(cos位点)。中间约1/3的序列为中间基因簇(centralgenecluster)，两端为DNA左、右臂。λ基因组的中间基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。λ噬菌体（二）病毒载体◆λ噬菌体载体可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，广泛用于各类基因库的构建。(三)克隆大片段载体粘粒载体、细菌人工染色体和酵母人工染色体载体等。粘粒载体（cosmid）是一类含有cos位点的质粒载体.兼有λ噬菌体的高效感染能力和质粒的易于克隆和选择的优点，既能像质粒一样在寄主细胞内复制，又能象λDNA一样被包装到噬菌体颗粒中去。与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点：具有cos位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制；有像质粒一样的选择标记；cosmid载体比较小，但能插入较大的外源片段，可克隆外源片段的长度在15~45kb之间。由于cosmid载体的大片段克隆能力，多用于基因组文库的构建，而λ噬菌体载体多用于cDNA文库的构建。已有多种粘粒载体可用于基因克隆，pJB8是最常用的粘粒载体之一粘粒载体细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome，BAC）◆BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移1Mb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100kb以上的DNA片段。◆带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小，具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。酵母人工染色体（yeastartificialchromosome，YAC）◆酵母人工染色体具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。◆YAC可以接受1-2Mb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体(humanartificialchromosome，HAC)的研究。三基因分离方法基于基因库的分离基因方法T-DNA标签克隆基因基于PCR的基因克隆人工合成基因1构建基因文库基因文库(library)是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因文库中分离基因，首先要构建基因文库。只有利用合乎要求的基因文库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。（一）基于基因文库的分离基因方法核基因文库◆核基因文库(genomiclibrary或genomicbank)是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。◆通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度(大于15kb)的DNA片段，与适宜的载体连接构成重组DNA分子,选择相应的宿主细胞用于克隆。载体可以是质粒，噬菌体，BAC或YAC等（一）基于基因库的分离基因方法◆理想的核基因文库应当能包括全部的基因组序列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。◆检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：◆例:人类基因组3.0x106kb,以λEMBL作载体，插入片段的平均长度为17kb，p为99%时,基因库应有8.1x105个重组噬菌体。1.核基因库染色体基因库◆将基因组的一部分（如一条染色体）用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。果蝇X染色体上的一个片段，具有50多个多线染色体带，利用微切割技术切割，抽提DNA，构建染色体片段基因库。在人类基因组项目研究中，利用流动细胞分拣技术将人类染色体分开，构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。在酵母菌中，利用一种改良的脉冲电泳方法，将酵母菌的16条染色体据分开，用于构建染色体库。cDNA库◆以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA(cDNA)，构建的基因库◆cDNA库仅具有用于分离mRNA的细胞或组织内表达的基因的mRNA序列，仅包括基因组的部分基因序列。◆构建什么样的基因库取决于研究目的。cDNA库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。如分离在某一细胞或组织高效表达的某种基因。◆通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。cDNA库2筛选基因库◆从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。◆常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。◆将重组噬菌体(来自基因库)感染的宿主细菌细胞与少量培养基混合培养，噬菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑。◆将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，变性，用标记的探针与膜上的噬菌体DNA杂交，杂交膜用X-光片放射自显影，检测杂交信号。◆与探针杂交的噬菌斑即为阳性克隆。根据杂交信号的位置，找出培养皿中所对应的噬菌斑，培养，制备DNA。菌斑杂交法筛选λ噬菌体核基因库菌落杂交技术寻找目标DNA克隆从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行测序才能进行生物信息分析和功能预测。（三）序列测定和分析限制性酶图谱◆一个15kbDNA片段的限制性酶图谱构建★实验过程：首先将阳性克隆DNA分装在3个管中，分别用不同的酶及酶的组合酶切DNA。酶切的产物用于琼脂糖凝胶电泳，染色，在紫外灯下可见到DNA带。各条带的分子量大小可根据分子量标记估测。限制性酶图谱★结果分析●从凝胶电泳结果可见，模式Ⅱ就是这个15kbDNA片段用上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。●将不同DNA用限制性酶消化，产生的多态性，即限制性酶片段长度的多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，用来分析DNA水平的变异程度，进行基因组图谱分析。限制性酶图谱（二）T-DNA标签克隆基因基本原理：利用T-DNA插入突变创造突变体，获得各突变体的纯合材料；然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列；用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析。T-DNA载体构建↓转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子↓筛选T2，获突变子，应为3:1分离↓确定T-DNA与突变型共分离的个体↓产生纯合后代↓克隆T-DNA两侧的植物DNA↓利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因↓基因功能的验证（三）基于PCR的基因克隆基于PCR的DNA克隆与基于载体的克隆技术相比具有一定优越性。PCR反应速度很快，可以在几个小时内完成，而载体克隆需要几周时间。PCR反应非常灵敏，可以用