第11章基因工程新技术

第11章基因工程新技术1.λRed和RecET重组系统及其应用2.位点特异性重组系统及其应用3.基因打靶4.基因抑制技术早在1990s,研究者发现在酿酒酵母等真菌中具有高效的同源重组系统，仅需要20~40bp长的同源区即可发生重组。可以方便的利用PCR产物进行基因打靶或替换。细菌的同源重组频率较低，且需要较长的同源区段.1.λRed和RecET重组系统及其应用E.coli自身的同源重组系统主要包括：RecBCD,RecE,RecF系统，其重组效率均较低，且对同源区要求为：1–2kb。最主要的重组系统RecBCD在dsDNA同源区为50–100kb(通过接合转移和转导)，才能高效重组。经修饰过的RecBCD及RecA系统能在Chi位点(crossoverhotspotinstigator,GCTGGTGG)高效重组，同源区段长度一般不低于5kb，重组需要DNA片段两端有同向的CHI位点。如果人工构建这样的片段，其重组几率为10-51998年左右，随着对λ噬菌体重组系统的深入研究，发现该重组系统可以在E.coli中实现高效同源重组，且同源区长度要求极低：约40bp。后来，在Rac噬菌体中发现类似的重组系统。随着该技术的应用，出现了一个新的术语：Recombineering(recombination-mediatedgeneticengineering)isageneticandmolecularbiologytechniquebasedonhomologousrecombinationsystemsinE.coliandotherbacteriamediatedbyphageproteins,eitherRecE/TfromRacprophageorRedalpha/beta/gammafrombacteriophagelambdaλRed/ETrecombinationsystemsarehighlightedbytheirabilitytocrossPCR-generatedsubstratesbearingsmallregionsofhomologytothetargetgene(40–50bp)intobacterialchromosomes,allowingbacterialgeneticiststoperformPCR-mediatedgenereplacement(1)λRed系统及rac噬菌体的RecET系统的原理Red系统包括3个基因:exo,bet和gamexo基因编码λ核酸外切酶，其活性形式是一种环状三聚物分子,中间有一中空的通道,通道的一端可容纳双链DNA分子,另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端,从DNA双链的5′端向3′端降解DNA,产生3′突出端。(RecE)Beta蛋白是一种退火蛋白,自发地形成环状结构(12–18subunitsperring),,紧紧地结合在单链DNA3′突出端,防止DNA被单链核酸酶降解,同时介导互补单链DNA的退火,双链DNA退火完成后,Beta蛋白从DNA双链上解离下来。Beta蛋白在Red同源重组过程中起着决定性的作(RecT)Gam蛋白可与RecBCD结合,抑制其核酸外切酶活性，防止对外源DNA的降解。宿主菌用recBCD缺陷株有利于该系统的高效重组。λRed系统的重组效率约比RecET系统高3倍。★(2)主要应用需要辅助质粒，上面带有诱导表达的重组系统。为避免本底表达对细胞的影响（毒性、诱变等效应），辅助质粒多为温敏性质粒，可在高温下被消除。PCR产物扩增诱导培养含pKD46大肠杆菌转化PCR片段，培养2h后涂布抗性平板，高温培养I基因敲除及markerfree操作（需结合位点特异性重组技术）II结合反向筛选进行基因替换正向筛选：含有标记基因的克隆在筛选平板上长出，不含标记基因则死亡。反向筛选：也称为负筛选，含有标记基因的克隆死亡，不含标记基因的克隆正常生长catsacBgeneAgeneAMutantcatsacBcatsacBgeneAMutantStep1Step2例：cat正筛选标记，sacB负筛选标记chloramphenicolMediumsucrose重叠延伸PCR基因敲除catsacBgeneAgeneAcatsacBcatsacBgeneAStep1Step2Geneinversion（smallfragment)III介导单链DAN重组，进行基因修饰如果向细胞中导入ssDNA(DNAoligo),则不需要Exo蛋白就能够与同源区退火，实际上，Bet单独作用可以使70-basessDNAoligo(SSO)与染色体的同源区退火互补而发生重组，其频率约2×105/108,比dsDNA略高。如果存在Gam蛋白，则重组效率可提高(5-fold）.40–60bp单链的重组效率下降5倍。另外，和滞后链重组的效率高于前导链。由于不能插入标记基因，使得其只能应用于具有明显表型特征的基因修饰。改进：MMR(specifcallyremovetheoligo-directedbasechange)系统缺陷株中，重组效率会提高2个数量级，可高达25%！这意味着不再需要标记基因，可以进行数个碱基的替换、插入或缺失。mutS:Methyl-directedMismatchRepair重大改进：MAGE技术（MultiplexAutomatedGenomeEngineering）1.多种ssDNA并行重组，同时进行多位点修饰。2.多轮循环重组，提高多位点修饰的几率3.适于高通量的随机优化缺点：对于多位点随机优化，需要高通量筛选技术，或具有明显的表型特征只能进行短序列的修饰（如RBS位点）ProgrammingcellsbymultiplexgenomeengineeringandacceleratedevolutionNature460,894-898markermarker2IV染色体大片段复制复制染色体上的基因：加入PCR产物，引物设计时上游引物与目标基因下游序列同源，下游引物与目标基因上游序列同源，第一次重组造成染色体断裂，第二次重组一条染色体修复，并造成目标基因多一个拷贝。引物设计时加入同向排列的特异性位点，可弹出MARKER应用该技术可复制长达1Mbp的序列。2.位点特异性重组系统及其应用位点特异性重组重组发生在特殊位点上，此位点含有短的同源序列,供重组蛋白识别。位点特异性重组与同源重组的区别重组位点限制：有同源序列的长短：短重组酶的专一性：有重组效率：高达100%常见的位点特异性重组系统λ噬菌体系统：λ噬菌体编码λ整合酶（integrase，Int重组酶，不可逆）、来自E.coli的整合作用宿主因子（IHF，integrationhostfactor）、切除酶（excisionase）P1噬菌体系统:Cre重组酶（可逆）2m质粒系统：FLP重组酶（可逆）链霉菌噬菌体C31系统（不可逆）均可广泛应用于真核细胞中λ噬菌体POP’包装感染宿主POP’×BOB’IntIntIHFIHFXisBOP’POB’λ噬菌体的整合和切离两边为13bp反向重复序列，中间位8bp非对称核心序列（1）重组机理如果一个DNA分子上两个特异位点之间发生重组，其后果有两种可能性：两个位点之间的片段或丢失，或被颠倒生物能够利用这种重组倒置来控制基因的表达因为DNA的一正一倒两种排列法可以相应地表达两种不同的蛋白质，细胞就可根据需要作出选择。Cre重组酶催化位点：loxP位点loxPloxPloxPloxP当基因组含有一个重组酶识别位点时，转入基因可以发生位点特异性整合，但必须解决整合的稳定性问题loxp位点的点突变Cre酶无法有效识别降低基因丢失几率：突变点loxp位点的点突变Cre酶无法有效识别实现稳定的基因颠倒：突变点或者采用类似于λred系统的策略，重组酶基因在温敏性辅助质粒上诱导表达（2）主要应用I利用位点特异性重组控制转入基因的表达将一个序列置于目标基因与其启动子之间（如转录终止单元＋loxP序列）阻遏基因的表达将cre基因置于诱导启动子控制之下，控制Cre重组酶的表达，从而控制目标基因的表达loxPloxPII条件缺失突变体的构建在目标基因的两侧引入特异性重组位点将cre基因置于诱导启动子或具有组织特异性的启动子控制之下，在某种条件下使Cre重组酶表达，从而缺失目标基因优点：同源重组造成“完全的”基因敲除，而同源重组和位点特异性重组结合后可以对基因敲除进行时间和空间上的控制，例如可以研究致死型基因在特殊发育阶段的效应、研究基因是否在某种组织中表达。要避免Cre重组酶的背景活性III利用位点特异性重组进行染色体工程markermarkermarker1marker2FRT/loxPFRT/loxPFRT/loxPFRT/loxPFRT/loxPFRT/loxP位点特异性重组大肠杆菌中采用该方式一次性删除117-165-kbp片段，效率100%Markerfree操作，但不属于无痕操作，每次重组留下一个疤痕，造成极性效应，多影响下游基因表达。多个疤痕对后续操作也有不利影响例：植物中染色体大片段的缺失gusA：编码β-葡(萄)糖苷酸酶，报告基因Ds:植物转座子染色体大片段颠倒：两个特异性位点反向排列，重组酶表达后，部分细胞的两个位点之间序列颠倒。FRT/loxPFRT/loxPmarker1marker2marker1marker2基因融合tagsequenceloxP/FRTsequencegeneACterminalsequence(notranslationstopsignal)markergeneAmarkermolecularcloningfreeAsinglechromosomalFRTsitebecomesthesubstrateforrecombinationwithFRT-containingreplication-deficientplasmidsthatcarrieslacZandlacY,designedinsuchawaytocreateeitheratranscriptionalortranslationalfusiontothepromoterofinterest.3.基因打靶及无痕操作技术基因打靶：利用外源DNA与染色体DNA的同源性进行同源重组，从而定点修饰改造染色体DNA的一类技术。（1）主要方法单交换同源重组双交换同源重组二次单交换同源重组（属于无痕操作技术）其它无痕操纵技术I单交换同源重组法利用整合性质粒上与染色体DNA同源的区段进行同源重组，通过整合性质粒插入染色体来达到对染色体DNA的复制、失活、启动子替换等目的。原理图：启动子+完整orfA:复制orfA的5’端或中间区域：失活orfA的3‘端区域：对基因A表达无影响，在染色体上多了一个不完整的orfA拷贝（缺5’端）诱导启动子+5‘端：实现A基因的启动子替换、构建条件敲除株构建整合质粒：原启动子+orfA5’端与报告基因的融合片段（转录融合、翻译融合均可）可以通过报告基因研究原启动子的表达规律，即基因A的表达规律对于高效短同源重组系统，可用两端有短同源区的PCR产物直接进行基因打靶（见red系统），省去克隆步骤。对于长同源区重组系统，无法通过PCR引物引入同源区，需要经过多次克隆构建基因打靶质粒，然后转化质粒进行基因打靶II双交换同源重组Marker2Marker2可实现基因敲除(B)及基因的异位整合表达(A)orfB白喉毒素A基因（DTPA)的负筛选作用：A亚基抑制蛋白合成，不需加筛选药物，从而避免真核细胞的非同源重组整合neo基因的正筛选作用，对氨基糖苷类抗生素G418的抗性单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)基因的负筛选作用，将丙氧鸟苷或非阿尿苷（FIAU）变为毒性物质，在含丙氧鸟苷或FIAU培养基中筛选基因寻靶质粒Cre表达质粒突变基因动物基因打靶过程：P319图14.1，若不需弹出筛