第14章基因工程-XXXX-12-1

第14章基因重组和基因工程GeneticRecombinationandEngineering生物的变异不可遗传的变异：由于环境因素的影响而引起的性状改变可遗传的变异基因突变基因重组染色体变异（生殖细胞内的遗传物质的改变引起的）基因重组主要内容一、自然界的基因重组：1.同源重组(homologousrecombination)；2.转化（transformation）；3.转导(transduction)；4.转座(transpostion)。二、基因工程：1.获取目标基因(targetgenes)；2.选择载体(carriervector)；3.目的基因与载体本连(ligation)；4.重组体的筛选与鉴定(screening)；第一节自然界DNA重组和基因转移DNARecombinationandGeneTransfer第一节DNA重组SectionIDNArecombination接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)转座(transposition)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组是最基本的DNA重组方式Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体（见模型图右边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体中间含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体基因修复Hollidayintermediate的电镜照片二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。可接合质粒如F因子(Ffactor)细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。质粒（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合位点特异重组(site-specificrecombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。（一）λ噬菌体DNA的整合λ噬菌体的整合和切除λ噬菌体：attPPOP、大肠杆菌：attB/attλBOB、1.整和：BOB、+POP、BOP、+POB、2.切除：BOP、+POB、BOB+POP通过attP和attB间的相互重组，环状的噬菌体DNA转换为整合的原噬菌体，原噬菌体通过attL和attR间的相互重组而切除1.POP’:O为15bp(核心)富含A-T的非对称序列；P为-160~0的160bp序列P’为0~80的80bp序列共240bp2.BOB’:B为-11~0序列B’为0~11序列共23bp位点专一性重组的核苷酸序列（二）细菌的特异位点重组沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变（三）免疫球蛋白基因的重排轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLVDJC免疫球蛋白(Ig),由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成,分别由三个独立的基因族编码,其中两个编码轻链(和),一个编码重链。重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段86v基因片段14号染色体9j基因片段通过基因重排获得功能型免疫球蛋白重链基因11C基因片段100kb30D基因片段免疫球蛋白重链基因片段重排与组织特异性表达vDvvDDCJJJCvDJCIGH基因座的分布情况V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程四、转座重组大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA称为转座子transposition。IS家族的结构：①两端有短的正向重复序列（directrepeats,DR），②略长的反向重复序列（invertedrepeats，IR）以及1kb左右的编码区，③它仅编码和转座有关的转座酶。对靶的选择有三种形式：随机选择，热点选择和特异位点的选择。（一）插入序列（insertionsequence，IS）IRTransposaseGeneIR插入序列的复制性转座转座子(transposons)——从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L由转座子介导的转座1.可引起基因突变——插入或切离；2.改变染色质的结构（缺失、倒位等）；3.可以插入新基因（ampR、terR等）；4.在靶序列上引入新的转座子序列，原来序列保持不变；5.在靶序列上造成同向重复序列；6.产生新的变异，有利于进化。转座子的遗传学效应DNARecombinationTechnique第二节重组DNA技术重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，应用重组DNA技术制造医学上重要药物。1980年建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。现代基因工程的创始人P·伯格（美国,1926－）1972年，伯格把两种病毒的DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，首次实现两种不同生物的DNA体外连接，获得了第一批重组DNA分子，这标志着基因工程技术的诞生。伯格因此获得了1980年诺贝尔化学奖。1973年，美国斯坦福大学教授S·科恩和加州大学旧金山分校教授H·W·博耶将两个不同的质粒（一个是抗四环素质粒，另一个是抗链霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合质粒，并将其导入大肠杆菌，当该重组质粒进入大肠杆菌体内后，这些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且这种大肠杆菌的后代都具有双重抗药性。这表明“杂合质粒”在大肠杆菌的细胞分裂时也能自我复制。科恩随后以DNA重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。1977年，吉尔伯特（W·Gilbert）分别将编码胰岛素和干扰素的DNA经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。利用乳腺生产药用蛋白的转基因羊把白蛋白基因转入着乳腺中，这样，转入的白蛋白基因在羊乳腺中表达。通过其分泌不断产生白蛋白。通过分离、纯化，可以得到药用白蛋白，解决临床上病人对白蛋白的需求。转基因猪进行人体器官移植由于猪的器官，如心脏与人的大小和活动能力类似，且猪的数量充足，容易繁殖，可以充分满足临床需要，被医学界认为是人类器官移植的最佳提供者。在人体器官移植手术中，灵长类猿猴的内脏普遍为人们所看好。但医学研究发现，猿猴身上的一些病毒对人类十分有害。图：美国哈佛医学院的研究人员正将一头猪的肝脏取出来，为一位肝昏迷患者作替代肝脏。通过基因工程手段，将猪的一个能引发人体排斥反应的基因-GT基因被关闭，使猪的器官成功移植到人体内的可能性大大增加。GT基因控制产生一种酶，这种酶使猪细胞表面产生一种蛋白质。当猪的器官移植进人体时，人类免疫系统能识别这种蛋白质，从而产生强烈的排异反应。金稻GoldenricevitaminA=retinol-producedbyanimalsinliver,milkandeggsplantsdonotproducevitA-butsomeproduceß-carotene,aprecursorforvitAincluding“yellowvegetables”,yellowendospermcornandsorghuminmanydevelopingcountries,vitAdeficiencyisamajorproblem:胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!基因工程与药物研制环境保护通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。环境监测相关概念–DNA克隆–工具酶–目的基