血清清蛋白_γ-球蛋白的分离纯化与定量----薛彪。。。裴婕

1血清清蛋白、γ-球蛋白的分离与纯化与定量实验设计南方医科大学公共卫生与热带医学学院学院10级预防医学（食品安全）学号：3100091046姓名：薛彪学号：3100091047姓名：裴婕日期：2011年10月19日2摘要健康人或动物血清中含有丰富的血清清蛋白，α1-球蛋白，α2-球蛋白，β-球蛋白，γ-球蛋白等。血清白蛋白是血清中含量最丰富的蛋白质，占血清总蛋白量的50%以上，是维持血液渗透压的重要物质。血清清蛋白还是血液中脂肪酸的携带者。当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位。γ-球蛋白又称免疫球蛋白，在血清蛋白质中数量居第三，具有重要的一用价值。各种血清蛋白的功能，性质，结构有所不同。因此不同蛋白质的分子量、溶解度、在一定的带电情况等都有所不同，本试验就是利用各种蛋白质的差别，实现蛋白质的分离、纯化与定量。关键词：血清清蛋白γ-球蛋白蛋白质的差别分离与纯化目录1．前言………………………………………………………………………………22．实验目的…………………………………………………………………………33．实验原理…………………………………………………………………………44．实验器材与试剂…………………………………………………………………55．实验步骤…………………………………………………………………………66．结果及计算………………………………………………………………………137．实验预期及可行性评估…………………………………………………………148．注意事项…………………………………………………………………………159．参考文献…………………………………………………………………………31.前言血清蛋白是血浆里最丰富的蛋白质。每一个蛋白分子能携带七个脂肪酸分子。这血清蛋白模型些脂肪酸分子结合在蛋白的缝隙中，它们富含碳的尾部埋藏在里面安全地避开周围的水分子。血清蛋白同样能够携带许多其它的不溶于水的分子。尤其是血清蛋白，能够携带着许多药物分子，比如布洛芬。正因为血清蛋白是如此普遍地存在于血液中并且如此容易地被提纯，所以它成为科学家最早研究的蛋白质之一。今天，当需要一种蛋白质时，一种来源于牛体内的类似的蛋白在研究中被广泛地使用，这种蛋白叫做牛族血清蛋白或者称作BSA。许多酶在稀溶液中不稳定，解决的办法是加入一些牛族血清蛋白。在试验中它能使酶稳定，且相对地中性,不会影响酶的性质。而γ-球蛋白在血清蛋白质中的总含量也达到了第三位，在医学和临床上有着重要的意义。2.实验目的：2.1从血清中分离并纯化血清清蛋白和γ-球蛋白。2.2进行血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度鉴定。2.3进行血清清蛋白和γ-球蛋白的定量测定。43．实验原理：3.1粗提取（盐析法）在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性，而使蛋白质从水溶液中沉淀出成为盐析。蛋白质表面的电荷和水化膜是维持蛋白质亲水胶体特性的两个重要因素，当其中一个受到破坏，都会降低胶体的稳定性，使蛋白质分子凝聚而发生沉淀，从而达到盐析的目的。而各种蛋白质的颗粒大小所带电荷、亲水性都不同，盐析所需的最低盐浓度也各不相同，因此可以利用不同浓度的盐溶液分别析出各种蛋白质，从而达到蛋白质初步的分离。3.2脱盐用盐析法分离的得蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此必须首先去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等，本试验采用的是凝胶层析法，利用得失蛋白质与无机盐之间分子量的差异，当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径达的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔而析出，小分子的则滞留在凝胶颗粒中而后洗脱出来。3.3纯化离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的点正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。3.4纯度鉴定欲检测用上述方法分离的清蛋白和γ-球蛋白是否纯净，单一，可采用醋酸纤维素薄膜电泳对其进行纯度鉴定，以正常血清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和γ-球蛋白的纯度。正常人的血清蛋白经醋酸纤维素薄膜电泳后可得5条区带，本法纯化后的伽玛球蛋白在醋酸纤维电泳图谱上，仅在清蛋白和伽玛球蛋白位置上出现。53.5定量测定清蛋白，γ-球蛋白的定量测定可采用多种方法，如紫外吸收发，本实验采用双缩脲发。凡是具有两个或两个以上肽键的化合物，都可以在碱性溶液中与Cu2+形成紫色复合物，即为双缩脲反应，此化合物颜色的深浅与该化合物的浓度成正比，在54nm处有最大吸收峰。蛋白质有多个肽键，因此具有双缩尿反应，故可以用分光光度法来测定蛋白质的浓度。4.实验器材与试剂4.1实验材料和试剂4.1.10.3mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液4.1.20.06mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液4.1.30.02mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液4.1.41.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4AC溶液4.1.5饱和的硫酸铵溶液4.1.60.92mol/l磺基水杨酸4.1.70.05mol/lBaCl溶液4.1.8双缩脲试剂4.1.9蛋白质标准4.1.10健康人的血清或动物血清4.2仪器及器材：1.层析住2.烧杯3.吸管4.滴灌5.试管6.黑色反应板7.贴固定架8.螺旋夹9.离心管和离心机10.分光光度计和水浴箱4.3试剂的配制：4.3.10.3mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液：称取醋酸按23.12g，加蒸馏水800ml溶解，滴入稀氨水或稀醋酸液（注意混合均匀），调节PH至6.5后，加蒸馏水至1000ml。4.3.20.06mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水做5倍稀释。4.3.30.02mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水做3倍稀释。注意：上述三种溶液的PH必须准确，用蒸馏水稀释后营再测PH。由于醋酸铵可遇6热分解，故配置溶液时不得加热，配好后必须密封保存，以防PH和浓度发生改变，否则将影响分离蛋白质的纯度。4.3.41.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4AC溶液：称取NaCl87.7g溶于0.3mol/LPH6.5的醋酸铵溶液中至1000ml。4.3.5饱和的硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000ml蒸馏水中，在70~80摄氏度下搅拌溶解，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。4.3.60.92mol/l磺基水杨酸4.3.70.05mol/lBaCl溶液4.3.8双缩脲试剂：精确称取硫酸铜3.0g、酒石酸钾钠9.0g及碘化钾5.0g，各自分别溶于25ml蒸馏水中。将酒石酸钾钠和碘化钾溶液倒入1000ml容量瓶中，加入6.0mol/L氢氧化钠100ml，混匀。再加入硫酸铜溶液，边加边摇，最后加水定容至1000ml，储存于塑料瓶内。此试剂可长期保存，有储存瓶内有黑色沉淀出现，则需重新配置。4.3.9蛋白质标准：用微量凯氏定氮法准确测出牛血清清蛋白或酷蛋白的蛋白含量，然后用15%氯化钠-麝香草酚溶液稀释成梅1ml蛋白质含量为6.0mg，此蛋白质标准液4摄氏度可保存八个月。4.3.100.9%氯化钠溶液。5.实验步骤5.1葡萄糖电泳层析柱的准备（1萄糖层析柱的准备步骤）步骤操作（1）凝胶的准备称取干燥葡萄糖凝胶G-25，按每克干胶假加入蒸馏水约50ml。置于沸水浴中1h，取出冷却，待凝胶下沉后，倾去含有细微悬浮物的上层液，然后重复处理两次，加入两倍量的0.02mol/l,PH6.5NH4AC缓冲溶液，轻轻搅拌，静止片刻待凝胶颗粒沉降后，倾去上层液7注意：a.沸水浴过程中要经常摇动，使气泡逸出。b.装柱时注意凝胶粒混合均匀，凝胶床内不得有界面和气体，凝胶床面平整。C.若凝胶床内出现界面、气泡或流速明显减慢时，将胶粒倒出，重新装柱。D.久用后，如凝胶床表面有沉淀等杂质滞留，可将表面一层胶粒析出，再填补新的凝胶。e.凝胶禁止保存于0摄氏度以下冰箱中，防止冻损胶粒。5.2DEAE纤维素离子交换层析柱的准备（2DEAE纤维素离子交换层析柱的准备的步骤）步骤操作（1）酸碱处理按100ml柱床体积称取DEAE纤维素14g，加入0.5mol/L的盐酸，搅拌均匀，放置30min后加约10倍量的蒸馏水，搅匀，放置片刻，待纤维素下沉后，弃去含细微悬浮物的上层液。如此反复洗涤2~3次后，置垫有细尼龙滤布的布氏漏斗中抽滤。用蒸馏水充分虑洗，直至流出液PH值约为4然后将DEAE纤维素置于烧杯中，加入0.mol/L的氢氧化钠处理一次。并以蒸馏水充分虑洗，直至流出液PH值约为7（2）装柱选用内径1.0cm，高10cm，顶部嵌装有砂芯滤片的层析柱，夹持在支架上，并保持垂直。首先向柱内加入少量的缓冲溶液，将上述处理的过的凝胶粒悬液连续注入层析柱内，直至所需凝胶床高度（约为7cm）为止。装柱后接上恒压储液瓶，或在柱下端流出口软管上加螺旋夹，调节流速约为2ml/min用缓冲溶液，洗涤平衡胶柱，然后夹死下端流出口，装柱操作即完成，可供蛋白质样品液除盐使用。（3）凝胶的再生及保存此凝胶层析柱可以反复使用，每次使用后应该一以所需缓冲液，流洗平衡即再生平衡，如暂不使用，应以含3mmmol/lNaN3d缓冲液洗涤后放置，防止凝胶霉变，久不使用宜将其由柱内倒出，加入NaN3至3mmol/l,湿态保存于4度的冰箱8（2）装柱，平衡经酸碱处理过的DEAE纤维素置于烧杯中，加入0.02mol/L，PH约为6.5的醋酸铵缓冲液，并用醋酸调节PH至6.5，倾去上层清夜，用此DEAE纤维素装柱。在层析柱下端出水口套上硅胶管，用螺旋夹拧紧，然后将上述处理好的的纤维素悬液倾入柱内，再拧松螺旋夹，使液体流出，直至所需的柱床高度约为6厘米为止。待液面接近纤维柱柱床表面。将螺旋夹拧紧，装柱后层析柱接上恒压储液瓶，用0.02mol/L,PH约为6.5醋酸铵缓冲液流洗平衡。，（3）再生及保存DEAE纤维素柱用过一次后，经1.5mol/L的氯化钠-0.3mol/L的醋酸铵缓冲液流洗。再用0.02mol/LPH为6.5醋酸铵缓冲液洗涤平衡后可重复使用。如暂不使用，应以湿态保存在含0.11mol/L正丁醇的缓冲液中，以防霉变。注意：a.HCl处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质。b.装柱时要注意装均匀，纤维素柱床内不得有界面和气泡，表面要平整。c.若柱床顶部有洗脱不下来的杂质，应将顶层纤维素吸弃，填补新的、经酸碱处理过的DEAE纤维素，并用缓冲液洗至平衡。d.多次使用后如杂质较多或流速过慢，可将纤维素倒出，先用1.5~2.0mol/NaCl浸泡，水洗，再重新装柱。5.3中性盐沉淀步骤步骤操作（1）盐析取离心管一个，加入0.8mol人或动物血清，边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀后室温下放置10min，离心10min（4000r/min）。用滴管小心吸出上清液置于试管中，作为纯化清蛋白之用（2）溶解沉淀向离心管的沉淀加入0.6mol蒸馏水，振摇使之溶解，作为纯化γ球蛋白用注意：上层清夜尽量全部吸出，但不可吸出沉淀物。95.4过凝胶层析柱步骤注意：a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。e.葡萄糖凝胶价钱昂贵，要回收再生避免损耗，严禁倒掉。5.5球蛋白的纯化：过DEAE纤维素阴离子交换层析柱步骤操作（1）调节层析柱液面葡萄糖