表面疏水1

真菌疏水蛋白表面展示对毕赤酵母细胞疏水性及共展示南极假丝酵母脂肪酶B的影响【摘要】酵母表达系统是近年发展迅速、应用广泛的一种真核细胞表达系统。基于毕赤酵母细胞开发的表面展示系统利用细胞壁蛋白将目的蛋白展示表达在细胞表面，既具有其表达效率高，培养成本低的优点，也具有表面展示系统产品回收方便，易于重复利用等优点，因此具有广阔的应用前景。为了提高酵母菌体表面疏水性，使其更好的在催化反应中发挥活力，本论文将真菌疏水蛋白展示在细胞表面，并评价疏水蛋白展示表达对细胞表面疏水性及共展示的CALB催化性能的影响。具体研究内容及结果如下：（1）疏水蛋白在酵母表面展示表达本研究构建了表面展示疏水蛋白HFBI的重组酵母ZfH21和展示疏水蛋白SC3的重组酵母ZfS21。通过WesternBlot分析证实“疏水蛋白-Gcw21”融合蛋白通过GPI锚定到酵母细胞壁，而免疫荧光实验证实了细胞表面存在该融合蛋白，且测定了细胞表面展示的疏水蛋白数量。结果发现ZfH21表面展示的疏水蛋白HFBI数量比ZfS21展示的SC3高52%。对细胞表面疏水性的测量发现ZfH21表面的疏水性比对照Z21提高8.0倍，而ZfS21表面疏水性比对照Z21提高6.3倍，进一步证实了疏水蛋白在ZfH21和ZfS21细胞表面的功能性展示表达。（2）疏水蛋白与CALB共展示表达本文首次对疏水蛋白与CALB脂肪酶在酵母细胞表面共展示进行研究。首先构建了通过Sag1p蛋白C端GPI锚定脂肪酶CALB的毕赤酵母表面展示重组菌株KhCSa，其细胞表面酶活力为水解活力623U/g-drycell，合成活力277U/g-drycell。以KhCSa菌株为基础构建了共展示表达CALB/疏水蛋白的重组酵母菌株KhCSa:ZfH21和KhCSa:ZfS21。对KhCSa:ZfH21和KhCSa:ZfS21菌株细胞表面的酶活力、CALB数量和疏水性研究发现其CALB量分别为KhCSa菌株的90.1%和12.1%；而酶活力分别为KhCSa菌株的151.2%和38.5%。对共展示菌株表面展示的CALB酶学性质分析发现，它们与KhCSa表面的CALB具有相同最适pH值、最适温度和底物适应性。另外对KhCSa:ZfH21和KhCSa:ZfS21细胞表面的疏水性分析，发现KhCSa:ZfH21菌体表面的疏水性（96.1%）略低于KhCSa（100%），而KhCSa:ZfS21菌体的疏水性（42.8%）明显低于KhCSa。说明共展示酵母表面的疏水性也受到表面展示的CALB影响。（3）基于口蹄疫病毒2A肽的共展示系统构建本文将口蹄疫病毒2A肽应用于酵母表面共展示研究中。首先构建了通过Sed1p蛋白C端GPI锚定脂肪酶CALB的毕赤酵母表面展示重组菌KfCSe，其细胞表面酶活为水解活力529U/g-drycell，合成活力217U/g-drycell。以KfCSe为基础构建了基于2A肽的共展示表达双CALB的重组酵母菌株KfCSe2AhCSa，其CALB-Sed1p的展示量达到KfCSe1菌株的94.3%，而CALB-Sag1p展示量达到KhCSa菌株的63.9%。KfCSe2AhCSa菌株水解酶活力几乎等于按比例加和的KfCSe1菌株与KhCSa菌株水解酶活之和。说明2A肽对其介导的上游蛋白表达影响小，而对下游蛋白表达量的抑制作用明显，且酵母菌体表面展示的CALB数量与其水解活性成正比。另外构建了基于2A肽的疏水蛋白/CALB共展示酵母菌株KfH212AhCSa和KfS212AhCSa，其细胞表面的水解活力分别为427U/g-drycell和70U/g-drycell，说明2A肽可用于疏水蛋白/CALB共展示酵母系统的构建。（4）疏水蛋白介导的CALB定向固定化初步研究本研究分别构建了CALB与HFBI和SC3融合表达的重组酵母KfCH和KfCS。经菌体酶活力检测发现KfCH的菌体表面具有329U/g-drycell的水解酶活力和203U/g-drycell的合成酶活力，而KfCS的菌体表面具有92U/g-drycell的酶活力和89U/g-drycell的合成酶活力。根据SDS-PAGE电泳图分析发酵液中融合蛋白浓度分别为5.6mg/L（KfCH）和0.4mg/L（KfCS）。对KfCH菌体的水解酶活力进行热稳定性检测发现经过55oC热处理2h，KfCH菌体仍剩余31%的水解酶活力。对发酵液中的“CALB-疏水蛋白”融合蛋白在亲水性和疏水性材料表面进行定向固定化实验，发现CALB-SC3对表面性质单一的亲水性和疏水性材料都具有比CALB-HFBI更好的吸附效果且更牢固。另外估算CALB-SC3在疏水性聚丙烯材料表面的吸附用量为0.82μg/m~2。【关键词】真菌疏水蛋白；南极假丝酵母酵母脂肪酶B；共展示；疏水性；定向固定化；【文内图片】I型疏水蛋白（SC3）和II型疏水蛋白（CU）半胱氨酸连接模式不同角度观察的HFBII蛋白“疏水面”结构EAS（黄）HFBI（紫）和HFBII（绿）蛋白结构叠加图Grifolafrondosa的I型疏水蛋白HGFI膜在原子力显微镜下观察的图像1.其疏水原理真菌疏水蛋白HGFI是本实验室从毕赤酵母菌株中分离鉴定出的一个真菌疏水蛋白HGFI。研究表明真菌疏水蛋白HGFI具有很好的表面结合和修饰活性，在碳纳米管功能化、抗体固定化、生物医学材料表面修饰等封面均表现出优异的性能，具有很高的研究和应用价值。但由于真菌生长周期长、蛋白产量较低且分离纯化需要强氧化性酸三氟乙酸，限制了真菌疏水蛋白HGFI的研究和应用。通过构建毕赤酵母表达载体pPIC9-hgf1并将其成功转入毕赤酵母细胞，实现了真菌疏水蛋白HGFI在毕赤酵母中的大量表达。通过中空纤维膜超滤的方法，我们对毕赤酵母诱导表达的HGFI进行了浓缩和脱盐。超滤脱盐、浓缩的重组HGFI(rHGFI)在阳离子交换柱色谱层析中可以得到有效分离；SephadexG75凝胶过滤柱层析同样也可以实现对超滤样品的有效分离。经对两种色谱方法纯化的蛋白进行蛋白和电泳分析表明超滤法结合阳离子交换柱层析法更适合作为纯化rHGFI的方法。2.作者的单位和头像孙宇飞，华南理工大学，发酵工程，2013，博士3.文中使用了温泽模型，温泽模型中，液体填满固体表面所有的凹槽结构。温泽模型显示，表面微结构会放大表面的亲水或疏水倾向。温泽模型在较粗糙时失效，因为空气会在凹槽中形成气垫。4.其亲水、疏水效果的评价接触角测定和X-射线光电子能谱实验表明，重组rHFBI能够很好地在疏水性的硅化玻璃和亲水性的云母表面成膜。水油分散实验表明，毕赤酵母表达的真菌疏水蛋白rHGFI具有更好的乳化能力，能更长久地稳定油水混合系，使油滴不容易从水溶液中聚集析出，而发生分层现象。5.【参考文献】中国学术期刊网络出版总库[1]潘志友,韩双艳,林影,郑穗平.南极假丝酵母脂肪酶B的酿酒酵母表面展示及其催化己酸乙酯的合成[J].生物工程学报.2008(04)[2]刘必胜,刘新垣,钱程.构建多顺反子表达载体的有效工具——FMDV2A[J].生物工程学报.2007(05)[3]赵天涛,高静,李伟杰.南极假丝酵母脂肪酶B的催化机理及应用前景[J].分子催化.2005(02)[4]丁靖志,于雷,王洪辉,张宝华,乔明强.真菌疏水蛋白的结构和功用[J].生物学杂志.2004(05)[5]曹黎明,陈欢林.酶的定向固定化方法及其对酶生物活性的影响[J].中国生物工程杂志.2003(01)[6]林福呈.真菌疏水蛋白的研究进展[J].微生物学报.2001(04)国际期刊数据库[1]EdaÇelik,PınarÇalık.Productionofrecombinantproteinsbyyeastcells[J].BiotechnologyAdvances.2011(5)[2]Jun-huiZhang,YingLin,Yu-feiSun,Yan-ruiYe,Sui-pingZheng,Shuang-yanHan.High-throughputscreeningofBfactorsaturationmutatedRhizomucormieheilipasethermostabilitybasedonsyntheticreaction[J].EnzymeandMicrobialTechnology.2012(6-7)[3]SaiWen,TianweiTan,HuiminZhao.ImprovingthethermostabilityoflipaseLip2fromYarrowialipolytica[J].JournalofBiotechnology.2012(2)[4]NaumihM.Noah,MarcellsOmole,SamanthaStern,SiyiZhang,OmowunmiA.Sadik,EuodiaH.Hess,JasminaMartinovic,PriscillaG.L.Baker,EmmanuelI.Iwuoha.Conductingpolyamicacidmembranesforsensingandsite-directedimmobilizationofproteins[J].AnalyticalBiochemistry.2012(1)[5]DavideCecchini,RobertoPavesi,SaraSanna,SimonaDaly,RobertoXaiz,MassimoPregnolato,MarcoTerreni.Efficientbiocatalystforlarge-scalesynthesisofcephalosporins,obtainedbycombiningimmobilizationandsite-directedmutagenesisofpenicillinacylase[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology.2012(6)[6]TsutomuTanaka,RyosukeYamada,ChiakiOgino,AkihikoKondo.Recentdevelopmentsinyeastcellsurfacedisplaytowardextendedapplicationsinbiotechnology[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology.2012(3)[7]AbhishekKumarSingh,MausumiMukhopadhyay.OverviewofFungalLipase:AReview[J].AppliedBiochemistryandBiotechnology.2012(2)[8]Gil-YongLee,Jong-HyunJung,Dong-HoSeo,JantraHansin,Suk-JinHa,JaehoCha,Yong-SungKim,Cheon-SeokPark.IsomaltuloseproductionviayeastsurfacedisplayofsucroseisomerasefromEnterobactersp.FMB-1onSaccharomycescerevisiae[J].BioresourceTechnology.2011(19)[9]HuaZhao,ZhiyanSong,OlarongbeOlubajo,JanetV.Cowins.NewEther-FunctionalizedIonicLiquidsforLipase-CatalyzedSynthesisofBiodiesel[J].AppliedBiochemistryandBiotechnology.2010(1)[10]KoWoonLee,KyoungseonMin,KyungmoonPark,YoungJeYoo.DevelopmentofanamphiphilicmatrixforimmobilizationofCandidaantarticalipaseBf