课题设计-PD-1-

PD-1、CTLA-4删除T杀伤效率的实验研究第一部分，DC和T的PD-1、CTLA-4表达情况：目的：了解PD-1、CTLA-4在DC细胞和T细胞活化前及活化后的表达特征。1.采取肿瘤病人外周血单个核细胞，ficoll分离出单个核细胞，贴壁法分离DC和T；2.DC细胞的PD-1、CTLA-4表达：DC扩增5天，分别于1、3、5天及成熟后的7天，流式细胞检测PD-1、CTLA-4（因为细胞膜内表达高，需要同时测膜内及细胞膜表面的）表达水平，目的：了解DC的PD-1、CTLA-4基础表达情况；3.贴壁法分离出的T细胞进行扩增培养，分别在培养的第1、3、5、7天及制备CTL（第7天）的第9、11、13、15、17、20天，分别检测PD-1、CTLA-4的表达。目的：了解T细胞活化前、活化后PD-1、CTLA-4的表达情况，同时了解活化后的持续时间；第二部分，肿瘤细胞株PDL-1及CTLA-4配体的表达情况1.采用结肠癌、直肠癌、胃癌细胞株、或同系黑色素瘤细胞株（B16）；2.分别流式检测细胞株PD-1配体及CTLA-4配体的表达情况；3.选择配体高表达的细胞株，确定为靶细胞；第三部分，T细胞活化前后PD-1、CTLA-4删除的最佳时间点：1.于CTL制备前1天删除CTLA-4，然后制备CTL，并分别于第1、3、5、7、9天流式检测，确定删除后CTLA-4低表达能维持多长时间？确定删除处理的最佳时机。2.于CTL制备同时或制备后第2天（根据前述结果确定删除时间）删除PD-1，并分别于第1、3、5、7、9、11…….天流式检测，确定PD-1低表达维持时间？确定删除处理的最佳时机。3.两者删除后和Treg表达的关系？CD8+PD-1+T细胞对Treg功能的上调？CD8+PD-1-T细胞（删除后）对Treg功能的下调？第四部分，invitro杀伤实验：（一）CTLA-4删除T的杀瘤效应：1.采集肿瘤病人外周血，提取单状核细胞，ficoll分离，贴壁法分离DC和T；2.DC扩增5天负载抗原（细胞株抗原），制备DC疫苗；3.T细胞扩增至第7天，先删除CTLA-4（抗体或CRISPR/CAS9），后加入DC疫苗制备CTL；4.CTL继续扩增2天，流式检测CTLA-4表达；ELLISA检测上清中IL-2、INF-γ的分泌量（设置未删除的CTL为对照）；5.第9天进行96孔板Cytotoxicity杀伤实验（设置未删除的CTL为对照）；（二）PD-1删除T的杀伤效应：1.采集肿瘤病人外周血，提取单状核细胞，ficoll分离，贴壁法分离DC和T；2.DC扩增5天负载抗原（细胞株抗原），制备DC疫苗；3.T细胞扩增至第7天，加入DC疫苗制备CTL，同时删除PD-1；4.CTL扩增2天，流式检测PD-1表达；ELLISA检测上清中IL-2、INF-γ的分泌量（设置未删除的CTL为对照）；5.第9天进行96孔板Cytotoxicity杀伤实验（设置未删除的CTL为对照）；（三）PD-1，CTLA-4双删除T的杀伤效应：-----同上，第五部分，invivo杀伤实验：一、准备工作：1.实验动物选用SCID鼠；2.SCID鼠的人体免疫重建，并流式检测重建效率（人体CD4+T及CD8+T的比例）；3.分别于重建（Day0）后第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19天，流式检测人体T细胞的维持时间，确定人体免疫重建成功；4.制备PD-1删除或CTLA-4删除CTL杀伤细胞制剂；二、杀伤实验：（一）Prophylacticassay:1.人体免疫重建；2.重建后第2天，尾静脉回输CTL（1×109）预处理；3.造模；4.每日观察肿瘤生长情况、测最大径、绘制生长曲线；5.造模后2-3周切取肿瘤，测瘤重、体积，并照相、绘制图表；（二）Therapeuticassay:1.人体免疫重建；2.造模，至瘤体最大径0.5cm；3.尾静脉回输CTL（1×109）治疗；4.每日观察肿瘤生长情况、测量最大径、绘制生长曲线；5.治疗后2-3周切取肿瘤，测瘤重、体积，并照相、绘制图表；第六部分，免疫记忆时间及效应细胞在体内存留时间的研究：1.制备PD-1删除CTL及CTLA-4删除CTL；2.标记萤光抗体；3.SCID小鼠免疫重建（未标记的人体单状核细胞）；4.造模；5.标记萤光抗体的CTL回输；6.回输后第1、2、3、4、5周，分别采集外周血，荧光显微镜检测效应细胞残存量；7.流式检测CD4+T细胞比例（查文献确定检测指标）。