第6章 植物基因工程

第六章植物基因工程第一节植物基因工程的发展现状第六章植物基因工程植物基因工程植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作即以分子生物学为理论基础，采用基因克隆、遗传转化（根癌农杆菌Ti质粒介导法、基因枪法、原生质体介导法等），以及细胞、组织培养技术将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中，并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，从而使受体获得新性状的技术体系。转基因植物的理论前景和意义通过将目的基因导入农作物、园艺作物中，改变它们的遗传特性，使植物免受病虫的危害，或获得抗除草剂的特性，或改变种子中淀粉、蛋白质的含量和组成、或改变花的形状和颜色，或改变植物的育性和不亲合性以及改变植物的抗逆性等高等植物基因工程的发展历程1983年美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜1994年世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市1995年转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产2000年美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。抗虫转基因植物抗病转基因植物抗除草剂转基因植物转鱼抗寒蛋白基因的番茄转黄瓜抗青枯病基因的甜椒利用转基因改良植物的品质提高观赏价值英国研究人员最近称，新开发的紫色转基因番茄中含有在深色浆果中常见的营养成分，并证明可以防止老鼠体内的癌细胞蔓延。此项研究的重点是花青素，这种抗氧化剂存在于黑莓和黑醋栗等浆果中，被认为具有降低癌症、心脏病和某些神经系统疾病风险的作用。这种蓝玫瑰是转基因玫瑰，被植入三色紫罗兰所含一种能刺激蓝色素产生的基因，花瓣因而自然呈现蓝色。蓝玫瑰由日本三得利公司澳大利亚分支机构研究培育。完成蓝玫瑰在自然环境中的生长实验和研究后，三得利公司计划明年秋季把蓝玫瑰推向市场，预计市场规模可达数百亿日元。向小麦插入一种来自烟曲霉（Aspergillusfumigatus）的肌醇六磷酸酶基因，这种小麦的肌醇六磷酸酶最高可以在89摄氏度的时候保持稳定。这种名为肌醇六磷酸酶（phytase，亦称植酸酶）的酶可以帮助人体吸收锌和铁元素。将细菌基因dhlA和dhlB插入转基因烟草的基因组中，清除受污染土壤和地下水的卤化有机污染物。转基因植物可作为一种生物反应器生产药用蛋白和植物次生代谢产物，或生产某些有机化合物。转基因植物为人们研究某一基因功能及其再生长发育中的作用提供了强有力的工具。第二节植物基因工程方法第六章植物基因工程一原生质体介导法概念：以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外源ＤＮＡ直接导入植物细胞的方法。主要方法:1)PEG介导的基因转化2)脂质体（liposome)介导的基因转化3)电激法4)激光导入法5)显微注射法1PEG介导的基因转化原理：利用化学试剂，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(细胞促融剂)等，诱导原生质体摄取外源DNA分子，进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。案例：转基因烟草2脂质体介导基因转化原理：利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂质体转入受体细胞。特点：转化率高操作繁琐技术性高3电激法介导基因转化原理：利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔“，形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA进入原生质体。特点：转化率高；操作简便；容易造成原生质体损伤。４显微注射介导的基因转化原理：利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核，从而实现外源基因的转移。优点：方法简单、转化率高；纯物理方法，适用于各种植物和材料，无局限性；对受体细胞无毒害，有利于转化细胞生长发育；培养过程无需特殊选择系统。５激光微束介导的基因转化原理：将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。优点：操作简便；工作效率高；无宿主限制，适应于各种动植物；对受体细胞生命活动影响小；受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化二基因枪法（微弹轰击法）工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因的转化。动力类型：火药爆炸力；高压气体；高压放电操作步骤（1）制备DNA微弹；（2）准备靶外植体材料；（3）DNA微弹轰击；（4）培养轰击后的外植体．转化率影响因素金属微粒金粉颗粒较钨粒性质优良,但是价格昂贵.DNA沉淀辅助剂这些化合物对DNA在微粒上的黏附有重要作用,但对植物受体细胞也产生一定的伤害.DNA纯度及浓度微弹速度植物材料内在因素三、根癌杆菌介导法根癌农杆菌广泛亲染双子叶植物和裸子植物。根据根癌农杆菌诱导植物形成的根瘤中冠瘿碱的不同可将根癌农杆菌分为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型3种类型在根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒，简称Ti质粒。LBRBAuxiniaaMiaaH(tms)CytokininiptZ(tmr)Opine(tmt)Opine代谢区复制起始区Vir区TiplasmidTi质粒的结构与功能Ti质粒的图谱整个质粒160-240kb其中T-DNA12-24kbtms的编码产物负责：合成吲哚乙酸tmr的编码产物负责：合成植物分裂素tmt的编码产物负责：合成氨基酸衍生物冠瘿碱Ti质粒的结构与功能Ti质粒致瘤的分子机制损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。Ti质粒的结构与功能T-DNA的染色体整合机制T-DNA的染色体整合机制Ti质粒的结构与功能Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在着学多障碍：（1）质粒过大，造作困难（2）大型的Ti质粒有多个酶切位点（3）植物激素类的影响（4）Ti质粒中存在不起作用的序列（5）Ti质粒的局限性1Ti质粒的改造策略Ti质粒的改造除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；安装植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物基因的启动子和polyA信号序列；安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；共整合转化程序二元整合转化程序LBRBT-DNA外源基因植物细胞筛选标记Kmr大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒大肠杆菌筛选标记农杆菌筛选标记农杆菌ori大肠杆菌ori将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒；以上述重组农杆菌感染植物细胞。2根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理6个步骤：1）农杆菌对受体的影响（2）农杆菌附着到植物受体细胞（3）诱导启动毒性区基因表达（4）类似接合孔复合体的合成和装配（5）T-DNA的加工和转运（6）T-DNA的整合3.T-DNA转移的影响因素（1）农杆菌菌株（2）农杆菌菌株高侵染活力的生长时期（3）基因活化的诱导物（4）外植体的类型和生理状态（5）外植体的预培养（6）外植体的接种及共培养基因枪法与根癌农杆菌介导发的比较(1)基因枪法——多拷贝整合概率高，外源基因默表达农杆菌介导——低拷贝整合（多为单拷贝整合）转化效率较高。(2)基因枪法——纯物理转化，不存在物种的限制。农杆菌介导——存在宿主范围的局限性。(3)基因枪法适于以细胞器为转化目标的转基因研究。第三节转化子细胞的筛选第六章植物基因工程当采用某种转基因方法处理外植体后，通常外植体中仅仅只有几个少数细胞获得转化只有采取有效的转化方法，才能提高准确地选择到转化细胞。一般情况下，转化载体上除了带有目的基因外，大多还携带选择基因，以供转化细胞筛选使用。转化筛选细胞的方法主要有两种一是根据选择基因的特点在筛选选择培养基中加入能抑制非转化细胞生长的有毒物质如抗生素、除草剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以解除培养基中有害物质对细胞生长的抑制作用，这样只有转化细胞才能生长繁殖；另一种方式是，受体细胞为营养缺陷型细胞，在选择性培养基中不能生殖，而选择基因可以补偿这种缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长。一、植物基因工程中的选择基因植物基因工程中的基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因最常用的有新霉素抗性基因（neor）庆大霉素抗性基因（gentr）潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）等1、新霉素抗性基因（neor）新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G418卡那霉素、新霉素可通过与核糖体小亚基结合抑制蛋白质的合成，G418可通过抑制80S核糖体的功能而阻断真核细胞中的蛋白质合成新霉素抗性基因可使选择试剂磷酸化而失效。2.庆大霉素抗性基因（gentr）该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基因它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。该选择系统目前也有一定的应用，例如矮牛、烟草和番茄。3.潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都有很强的毒性。潮霉素林酸转移酶可通过对潮霉素磷酸化而使其失活。4.膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致非转化细胞发生氨的致死性累积。膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）是从吸水链霉菌中克隆的一种基因二、报告基因报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是够成功地导入体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。它应该不依赖于外界选择压力的存在，这一点也是它与选择基因的区别之处。理想报告基因的基本要求：1、受体细胞不粗在相应的内源等位基因的活性。2、它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。3、具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。目前最常用的报告基因有：ß-葡萄糖苷酸酶基因（gus）氯霉素乙酰转移酶基因3.荧光素酶基因ß-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因编码ß-葡萄糖苷酸酶存在于某些细菌体内，该酶是一种水解酶，能催化许多ß-葡萄糖苷酸类物质的水解绝大多数的植物细胞内不存在内源的GUS活性，许多细菌及真菌也缺乏内源GUS活性因而gus基因被广泛应用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用最多。氯霉素乙酰转移酶基因该基因来自大肠杆菌转座子Tn9它能够催化乙酰基团从乙酰辅酶A转移到氯霉素分子上，导致氯霉素分子发生乙酰化作用，从而使其失去活性。真核细胞中不含有氯霉素乙酰转移酶基因，无该酶的内源活性因而该基因可作为真核细胞转化的选择基因及报告基因。3.荧光素酶基因该基因有很多种，它可以催化荧光素发出荧光荧光素是荧光素酶催化的底物总称，不同荧光素的化学结构有一定差异甚至完全不同。荧光素酶基因的活性检测非常简单直接将被检的材料进入加有荧光素和ATP的缓冲液中，置于暗室用肉眼直接观察荧光，或覆盖X-光胶片曝光，也也用荧光光度计定量检测.第四节转化体的鉴定与证实第六章植物基因工程转化体的鉴定和证实的必要性为了验证外源基因整合到染色体.我们采用PCR技术Southern杂交技术为了验证外源基因是否表达.我们采用RT-PCR技术Northern杂交技术.Western杂交技术PCR检测外源基因的整合通过设计外源基因两端的特异引物采用PCR基因