第三章基因工程的常规技术

第三章基因工程的常规技术【教学时数】12小时【教学目录与学时安排】3.1凝胶电泳技术（1小时）3.1.1琼脂糖凝胶电泳的原理3.1.2琼脂糖凝胶电泳的影响因素3.2杂交技术（3小时）3.2.1探针与探针标记3.2.2Southern杂交3.2.3Southern杂交3.2.4Western杂交3.2.5菌落（嗜菌斑）原位杂交3.3PCR技术（2小时）3.3.1PCR技术的基本成分3.3.2PCR技术的原理和过程3.3.3荧光定量PCR3.4生物芯片（2小时）3.4.1DNA芯片3.4.2蛋白质芯片3.5基因文库构建（2小时）3.5.1基因组文库构建3.5.2cDNA文库的构建3.6酵母双杂交系统（1小时）3.6.1酵母双杂交系统的基本原理3.6.2酵母双杂交系统的应用3.6.3酵母双杂交系统存在的问题3.7DNA测序（1小时）3.7.1Sanger双脱氧链终止法3.7.2Maxam-Gilbert化学修饰法【教学目的】让学生掌握基因工程操作中常用的技术，包括常规技术生成原理，技术的应用范围，技术的缺点等。使学生对基因工程的常规操作技术能够了解并且学会应用这些技术设计、分析实验过程。【教学重点】分子杂交技术，PCR技术，文库构建技术等等。【教学难点】Westernblot,生物芯片，酵母双杂交技术等等。【教学方法】多媒体演示与讲解，启发学生讨论相结合。【教学过程与教学内容】：前言：基因工程的操作过程ADNA的体外重组（切、接）B重组DNA分子的转化和扩增（转、增）C转化子的筛选和鉴定（检）1.重组率的概念：重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。2.转化率概念转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA。转化率的影响因素：载体及DNA重组分子方面：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高转化方法方面：Ca2+诱导转化106-107/mgDNAλ-DNA转染107-108/mgDNA电穿孔转化106-109/mgDNA3.转化子的筛选和鉴定（检）（1）载体遗传标记检测抗药性筛选法显色筛选法（2）DNA片段大小检测限制性酶切图谱法：所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。第一节凝胶电泳技术（1小时）一、琼脂糖凝胶电泳的原理在电场的作用下，DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时，有电荷效应和分子筛效应。前者由DNA分子所带电荷量的多少而定，后者则主要与DNA分子的大小与构型有关。DNA分子在带负电荷的缓冲液中向正极移动。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与其分子量的对数值成反比关系，大分子量的DNA在电用时比小分子的DNA移动慢，这样可将不同大小的DNA分开。如将已知含有不同大小DNA片段的标准样品作电泳对照，那么可以在电泳后估计或计算出待测样品的分子质量。二、琼脂糖凝胶电泳的影响因素DNA分子大小（0.1－60KB）琼脂糖凝胶的浓度电泳缓冲液电压电泳时间三、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。区分范围：0.001－1kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种聚丙烯酰胺凝胶的应用：SSCPSNPDNA测序蛋白质分离蛋白质的双向电泳:根据IEF分离不同电荷的蛋白质，根据SDS－PAGE分离不同分子量的蛋白质。第二节杂交技术（3小时）分子杂交技术，它主要是根据两条单链DNA（或DNA与RNA）中互补碱基序列能专一配对的原理进行的。在一定条件下，单链DNA或RNA能与另一条单链DNA上互补的碱基形成氢键，从而使两条单链杂交形成双链DNA分子。通常利用已标记的某一DNA或RNA片段或合成一段寡核苷酸作为探针，探测重组DNA分子中是否有DNA片段与探针发生同源性杂交，然后利用放射自显影方法进行检测。一、探针的准备(一)探针类型基因组DNA或RNA人类染色体DNA片段，或外源DNA片段体外转录的cRNA或cDNAmRNA（二）探针标记同位素标记非放射性标记直接标记：酶，荧光素直接与探针相连间接标记：探针接抗原，检测物接抗体（三）探针标记方法缺口转译法寡核苷酸标记法末端标记法PCR法（四）探针必须满足的条件单链结构（双链DNA可用碱变性）足够长度（至少12个碱基）内部不含互补区二、Southern杂交Southern印迹转移试验（Southernblot）又称凝胶电泳压印杂交技术，是Southern于1975年建立的一种DNA转移方法。该法利用硝酸纤维素膜或经特殊处理的滤纸或尼龙膜具有吸附DNA的功能，先作DNA片段的凝胶电泳，并将凝胶电泳中的DNA区带吸附到膜上，然后直接在膜上进行同位素标记核酸探针与被测样品之间的杂交，再通过放射自显影对杂交结果进行检测。Southernblot不仅可以定位地确定DNA中的特异序列，而且还可根据DNA片段在凝胶中的泳动距离，确定特异DNA片段分子量的大小及其含量。在进行Southernblot时，先以限制性内切酶消化待检的DNA片段，然后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳完毕后，将凝胶放入碱性溶液中，使DNA双链变性，解离为两条单链。再在凝胶上贴盖硝酸纤维素膜，使凝胶上的单链DNA区带按原来的位置吸印到膜上。再将此膜置于含有同位素标记的核酸探针的杂交液中感作反应。按照碱基配对原理，如果被检DNA片段与核酸探针具有互补序列，就能在被检DNA的区带部位结合成双链的杂交分子，再通过放射自显影显示出来。DNA杂交的流程：1DNA电泳2转膜,转膜时要凝胶底面朝上，上盖硝酸纤维素膜3探针与膜变性4预杂交5杂交6洗膜7放射自显影检测三、Northern杂交Northern吸印杂交试验（Northernblot）又称为RNA印迹法，是对应于Southernblot而命名的。它的特点是电泳结果为RNA图谱而不是DNA图谱，即是将RNA样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素滤膜上，用同位素或生物素标记的DNA或RNA特异探针针对固定于膜上的mRNA进行杂交，洗脱除去非特异性杂交信号，对杂交信号进行分析，以确定目的基因的表达组织。操作方法大体上是，先提取总RNA或mRNA，在强变性剂如甲基汞或甲醛存在条件下（防止RNA形成二级结构环），进行琼脂糖凝胶电泳。电泳后，将胶上分离开的RNA吸印到化学处理过的纸或硝酸纤维膜上，用同位素标记的探针进行杂交，然后作放射自显影，这样可以在分子大小上将mRNA与相应克隆的cDNA进行比较。Northern印迹转移的结果一方面可以用于确定克隆的cDNA是否达到mRNA的全长，另一方面可以确定外源基因或内源基因在不同组织或不同发育时期的表达情况。四、菌落（嗜菌斑）原位杂交噬菌斑杂交法的基本步骤是将重组噬菌体感染的宿主菌倒在平皿上，待生成噬菌斑后，将与培养皿一样大小的硝酸纤维素薄膜盖在上面，每个噬菌斑中约105个噬菌体就影印转移到膜上。膜揭下后，用碱处理除去蛋白质外壳，使噬菌体DNA变性并同膜共价结合，然后用同位素标记的探针与之杂交，放射自显影检测。按照膜与培养基上预先做好的方法标记，将阳性噬菌斑挑出来扩增。五、Western杂交Westernblot是指经过SDS-PAGE分离（聚丙烯酰胺凝胶电泳）的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检查电泳分离的特异性的目的基因的表达的蛋白成分。Westernblot的操作流程通常是：首先进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，用考马斯亮蓝染色，检查蛋白质分离的效果；然后在电场作用下进行电转膜，把胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上；纤维素膜用10%小牛血清BSA封闭30分钟，以封闭未吸附蛋白质的部位，再将纤维素膜与第一抗体温育，冲洗后再封闭；接着与酶标第二抗体温育，最后加入酶促底物显色。第三节PCR技术（2小时）一、PCR技术的基本成分1模板DNA2一对引物3dNTPs4Taq酶5缓冲液6Mg2+7超纯水二、PCR技术的原理和过程PCR叫多聚酶链式反应，是利用碱基互补配对的原则，在体外快速扩增DNA的一种方法。首先，分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物，其中在DNA5`端的引物（P1）对应于上链DNA单链的序列，3`端的引物(P2)对应于下链DNA单链的序列，P1和P2按5`-3`方向相向配置。然后在含有引物、DNA合成底物dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP4种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物）的缓冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA模板，降低温度复性，使引物与模板DNA配对，利用耐热的DNA聚合酶便可以合成产物DNA。若引物和dNTPs过量，则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。三、PCR反应程序：1=94°C2min2=94°C30sec3=55-65°C30sec4=72°C1min5=Goto2，30cycles6=72°C5-10minHoldat4°C四、提高PCR特异性反应的因素：1特异性模板2高退火温度3较低浓度引物、酶和Mg2+4较少的循环数5较纯的模板与引物（无蛋白酶、DNA酶与EDTA污染）五、PCR技术的扩展：1巢式PCR：设计内外两对引物同时扩增目的基因片断，提高反应的特异性。2不对称PCR（asymmetricPCR）：不对称扩增，两条引物浓度50-100：1，所以主要扩增一条链。3反向PCR（inversePCR）：扩增已知序列两侧的未知序列。4多重PCR（multiplexPCR）：同时设计几对引物扩增同一条DNA链5逆转录PCR（retrotranscriptionPCR：RT-PCR）：以RNA为模板的PCR6荧光定量PCR：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析。六、荧光定量PCR：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析。标记方法：1.内插染料（SYBRgreenI）2.双标记探针（5端标记荧光分子，3端标记吸收或淬灭荧光的分子）3.分子信标：同上，双标记，自身环化时检测不到荧光，线性时荧光逐渐加强荧光定量PCR实时定量分析的优点：①全封闭的PCR过程，无需跑胶，无需后处理；②采用dUTP-UNG酶放