第三章基因工程第一节基因工程工具酶wangjx

第一节基因工程中的工具酶•限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割•DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化•核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割•核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成•核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接•核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰•其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等一、限制性内切酶（一）、限制修饰系统的种类（二）、限制性内切酶的定义、命名（三）、限制酶的特点（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）（五）、限制酶的用途（一）、限制修饰系统的种类1.I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），无特异切割位点。2.II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.coli中这两种基因位于质粒上。3.III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。（二）、限制性内切酶的定义、命名1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢSacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)（三）、限制酶的特点1.识别顺序和酶切位点１）识别４-8个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGGFokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外侧，产生５’-端突起２）富含ＧＣ３）对称性—双对称EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ2.末端种类１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组DNA分子。在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子３）平齐末端SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’EcoRⅠ的识别序列HaeⅠ的识别序列5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTTpAACNNNNN3’3‘NNNNNCAApTTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）酶切条件：酶切缓冲液低盐组：0～50mmol/LNaCl中盐组：50～100mmol/LNaCl高盐组：100～150mmol/LNaCl（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG（五）、限制酶的用途1.DNA重组2.限制酶（物理）图谱绘制3.突变分析（RFLP分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切附：IIS型限制酶的特点1.具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。2.酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1--20nt。3.酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。5.均为单体，分子量为47—108kD。酶切图谱的构建（a）请构建该环状DNA分子的酶切图谱酶切图谱的构建（b）二、DNA甲基化酶（一）、甲基化酶的种类与识别顺序1.限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤。在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：M.EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同M．HpaICmCGGHpaICCGG相同2.II型甲基化酶对限制酶活性的影响１）抑制同种限制酶的活性M.BamHIGGATmCC—BamHI(GGATCC)M.EcoRIGAmATTC—EcoRI(GAATTC)２）抑制不同种限制酶的活性a.顺序完全重叠如：M.ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠如：M.BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG）３）抑制不同种限制酶的部分活性M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.甲基化酶的用途１）改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成２）在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连甲基化酶人工接头RE用于基因组文库的建立用于cDNA的连接RERERE三、核酸酶（一）、外切酶III（ExoIII）1.一般特点：来自于E.coli，分子量28,000kD2.催化反应类型1)外切酶活性：3’→5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的ds-DNA，pH7.6-8.52)核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH7.6-8.53)3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH6.8-7.44)内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH7.6-8.53.外切酶活性特点1)反应底物：互补ds-DNA2)碱基释放速度：CA-TG3)反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解4.用途1)核酸（DNA）标记2)基因突变----缺失3)DNA序列测定时作顺序缺失5.使用注意事项1)正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度2)在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾)ds-DNA结构:切口,缺口,断口缺口(gap)切口(nick)断口(cut)3'HOP5'3'HOP5'5'P5'P5'P5'P5'P3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HOOH3'OH3'OH3'OH3'P5'P5'P5'P5'P5'P5'P5'3'HOP5'OH3'P5'RNaseHExoIII的外切酶和RNaseH的作用1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于顺序缺失ExoIIIExoIII[α-32P][α-32P]dCTPdCTP5'PP5'5'PP5'3'HOOH3'3'HOOH3'ExoIII用于DNA标记（二）、RNase（三）、RNaseH（二）、RNase大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。1.RNaseA分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）,用于除去DNA样品中的RNA分子2.核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA（三）、RNaseH作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。（四）、DNaseI1.特点：具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg2+存在时，两条链上的切口独立无关，Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置2.用途1)切口移位，制备DNA探针2)制备RNA样品时除去DNA分子3)基因突变时产生切口Mn++存在时Mg++存在时DNaseI作用特点DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI与PolI的切口移位PolI四、聚合酶包括DNA聚合酶和RNA聚合酶（一）、E.coliDNA聚合酶I（polI）1.E.coli的DNA聚合酶系统PolI参与DNA修复,具3’→5’和5’→3’外切酶活性polII同上具3’→5’外切酶活性polIII参与DNA复制,具3’→5’和5’→3’外切酶活性2.E.colipolI的特点1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响3）外切酶活性3.用途1）除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）2）补齐5’-突起端3）合成第二条cDNA4）切口移位制备探针其中用途2)和3)常用大片段（二）、T4DNA聚合酶1.特点：5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,为polI的两倍3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分别为40和4000nt/min,缺少5’到3’的外切核酸酶活性.2.用途：制备高比活性探针(1010cpm/μgDNA);DNA末端修饰---缺失外切酶活性聚合酶活性无dNTPdNTP(三)T7噬菌体DNA聚合酶•具3’到5’端外切核酸酶活性和持续合成能力较低的DNA聚合酶活性.•应用:1)合成DNA能力很强,可用于延伸很长的模板.2)可用于定点诱变中互补链的合成.3)3’末端的标记4)将双链DNA的黏性末端转变为平端.（四）、TaqDNA聚合酶1.特点：分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃，对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性2.用途：主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA分子因而可被扩增4×106倍。DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，它包括以下三个步骤：DNA模板变性(95℃)→与DNA引物退火(45℃)→引物延伸(75℃)TaqPol和PCR5’3’变性3’5’5’3’引物3’5’复