观察DNA和RNA在细胞中的分布

（二）观察DNA和RNA在细胞中的分布“观察DNA、RNA在细胞中的分布”是人教版生物必修一第二章第三节的实验。教科书建议使用人口腔上皮细胞做材料，进行固定、酸解、漂洗、染色等一系列操作，观察DNA、RNA在细胞中的分布。但在教学实践中发现，按照教科书所示的实验方法难以做出预期的实验结果。常见口腔上皮细胞整个被染成粉红色，既没有出现甲基绿的颜色，也不能清晰分辨RNA的颗粒结构。该实验原理是利用甲基绿和吡罗红对DNA和RNA亲和力的不同，让甲基绿与DNA结合，使DNA呈现绿色；让吡罗红与RNA结合，使RNA呈现红色。现今对这一染色机理有两种解释：电离作用与聚合作用。（1）电离作用：DNA和RNA都有磷酸基和碱基，为两性电解质，在一定的条件下可电离，因此都有等电点。甲基绿和吡罗红在水中电离后都产生阳离子。甲基绿电离后带两个正电荷，碱性较强。吡罗红电离后仅带一个正电荷，碱性较甲基绿弱。染色时两者竞争，碱性较强的甲基绿与细胞核形成极性吸着而结合，等电点为pH3.8~4.8。碱性较弱的吡罗红与细胞质吸附结合，等电点pH4.6~5.2。（2）聚合作用：甲基绿对聚合高的DNA有亲和力，吡罗红对聚合低的RNA有亲和力。由染色机理可见，甲基绿与吡罗红的细胞染色对pH要求很高。教材提供的试剂配方也提到B液需将pH调整到4.8，正是保证了甲基绿与吡罗红与细胞器结合的pH条件。可是根据教材所给的操作步骤，口腔上皮细胞需要经过5min的酸解和10s的冲洗，这一操作显然很难完全去除残留的盐酸，导致细胞在染色前已经形成低pH的环境，染液无法在适宜的pH下染色，最终染色失败。根据实践经验，若pH偏低，甲基绿染色效果不好；若pH偏高，则吡罗红染色效果差。在pH极低的环境下，甲基绿完全不着色。根据以上对染色原理及操作步骤的分析讨论，现提出一种以洋葱内表皮为实验材料的简化实验方法：1.简化的实验方法：（1）在干净的载玻片上滴加一滴现配的吡罗红甲基绿染色剂。（2）撕取洋葱内表皮，置于染色液中。（3）染色1min。（4）盖上盖玻片，吸去多余染液，显微镜观察。这一简化方法保证了细胞染色全程在适宜的pH下进行，能产生预期的染色效果，明显可见细胞核被染成绿色，细胞质里有颗粒状结构被染成红色。其次，利用植物细胞的特性，可省略固定及酸解步骤，节省操作时间，减少出错机会。经改进，本实验成功率达100%，实验操作时间节省60%。课堂上学生能有更多的时间进行显微镜观察，教师也有充裕的时间进行理论讲解与个别指导。这种简化方法既增加了学生的成功体验，也提高了教学效率，广受师生的欢迎与肯定。可根据具体染色情况，调整甲基绿水溶液与吡罗红水溶液的比例。2．实验的改进研究观察DNA和RNA在细胞中的分布是人教版高中生物学教材(必修1)中的一个实验,实验材料为人的口腔上皮细胞和洋葱鳞片叶内表皮细胞,实验基本步骤为:取细胞制片,将装片放在酒精灯火焰上烘干固定,然后放入装有30mL质量分数为8%的HCl溶液的小烧杯中,再将小烧杯置于装有30℃温水的大烧杯中保温5min,接着用蒸馏水冲洗载玻片10s,吸去水分后滴加甲基绿吡罗红染色剂染色5min,然后盖上盖玻片,用显微镜观察。众多教师反映,该实验结果不理想。人的口腔上皮细胞的细胞核和细胞质均被染色成紫红色,偶见一二个细胞的细胞核略呈蓝紫色。洋葱鳞片叶内表皮细胞实验效果较好些,但染色效果仍不明显。为此,本文在教材建议方法基础上对实验条件步骤进行了比较研究,取得了理想的结果。Ⅰ实验方法的改进探讨1.1观察人的口腔上皮细胞DNA和RNA的分布取8个装片,标上序号a～h。按表1方法分别制片,并观察实验现象。其中,装片d为教材提供的实验方法。表1人的口腔上皮细胞装片的不同制作方法步骤编号①滴1滴生理盐水在载玻片上②涂人口腔上皮细胞③烘干玻片④HCl水解⑤水洗⑥滴加1滴染色剂染色5min实验现象a＋＋60℃的电热鼓风干燥箱5min蒸馏水＋细胞核为紫红色b＋＋60℃的电热鼓风干燥箱5min1%NaHCO3溶液＋细胞核为紫红色c＋＋60℃的电热鼓风干燥箱－－＋细胞核为蓝绿色d＋＋火焰上5min蒸馏水＋细胞核为紫红色e＋＋火焰上－－＋细胞核为紫红色f＋＋火焰上方4cm处慢慢烘干－－＋细胞核为蓝绿色g＋＋电吹风低温慢慢烘干－－＋细胞核为蓝绿色h滴加1滴染色剂＋－－－染色5min细胞核为蓝绿色＋:进行此项操作,－:不进行此项操作a、b、d与其余装片比较,发现经过质量分数为8%的HCl水解的口腔上皮细胞的细胞核均被染成紫红色。分析可能有两个原因:①HCl水解确实能够改变口腔细胞细胞膜的通透性,加速染色剂进入细胞,但HCl也能使细胞中的DNA变性,因而无法与甲基绿结合发生颜色反应;②染色剂的染色条件是在pH4.8的环境下发挥作用,遗留的HCl改变了染色剂的pH,从而使细胞核染色失败。对比装片c、e、f、g、h的实验结果则发现,烘干装片时的温度也是实验成败的关键因素。酒精灯火焰温度在500℃左右,而DNA在高温条件下易变性,直接将装片置于火焰上烘烤,可能导致DNA变性,从而与吡罗红结合呈现红色。实验发现,h装片的制片过程不仅简单,而且实验效果好,现象明显。1.2观察洋葱鳞片叶内表皮细胞DNA和RNA的分布取10个装片,分别标a～j按表2方法分别制片。其中装片b为教材提供的实验方法。实验结论:装片g实验现象最明显。主要原因有:①在滴加染色剂之前用HCl水解材料,能够改变细胞膜的通透性,加速染色剂进入细胞,缩短实验时间,同时使染色质中的DNA与蛋白质分离,有利于DNA与染色剂结合;②水解后用质量分数为1%的NaHCO3溶液代替蒸馏水清洗材料。用蒸馏水清洗可能使HCl残留在细胞内,使细胞内的pH降低,造成甲基绿染色剂不容易着色。只有在染液的pH4.8时,甲基绿和吡罗红才能对所染的材料都具有亲和力,从而获得最佳的染色效果。因此用蒸馏水清洗的洋葱细胞的细胞核和细胞质会呈现紫红色;用质量分数为4%的HCl水解效果最好。HCl的浓度过高会破坏细胞结构,使细胞发生质壁分离,细胞质皱缩。表2洋葱内表皮细胞装片的不同制作方法装片序号水解水洗染色细胞核实验现象细胞质实验现象a--30min细胞核为蓝绿色,现象不明显细胞质为红色b8%的HCl蒸馏水5min细胞核为紫红色细胞质为紫红色,皱缩c8%的HCl1%的NaHCO3溶液5min细胞核为蓝绿色细胞质为紫红色,皱缩、破损d7%的HCl1%的NaHCO3溶液5min细胞核为蓝绿色细胞质为紫红色,质壁分离e6%的HCl1%的NaHCO3溶液5min细胞核为蓝绿色细胞质为紫红色,质壁分离f5%的HCl1%的NaHCO3溶液5min细胞核为蓝绿色细胞质为紫红色,质壁分离g4%的HCl1%的NaHCO3溶液5min细胞核为蓝绿色细胞质为红色h3%的HCl1%的NaHCO3溶液5min细胞核为蓝绿色,颜色较浅细胞质为红色,颜色较浅i2%的HCl1%的NaHCO3溶液5min细胞核为蓝绿色,颜色较浅细胞质为红色,颜色较浅j1%的HCl1%的NaHCO3溶液5min细胞核为蓝绿色,颜色较浅细胞质为红色,颜色较浅-.不进行此项操作Ⅱ改进后的实验步骤2.1观察人口腔上皮细胞DNA和RNA的分布①用消毒牙签在自己漱净的口腔内侧壁上轻轻地刮几下,把牙签上附有碎屑的一端,在载玻片上旋转地涂抹几下。涂抹时尽量将液滴晕开;②滴1滴甲基绿吡罗红染色剂在载玻片上,染色5min;③盖上盖玻片,用显微镜观察;④低倍镜观察:选择染色均匀、色泽浅的区域,移至视野中央,将物像调节清晰;⑤换40×物镜观察:调节细准焦螺旋,观察细胞核和细胞质的染色情况。2.2观察洋葱鳞片叶内表皮细胞DNA和RNA的分布①在洁净的载玻片上滴加2滴质量分数为4%的HCl溶液;②在洋葱鳞片叶内表皮上用刀片划出一个“井”字,“井”字中央的正方形边长约为0.5cm,用镊子将正方形的洋葱内表皮轻轻撕下,尽量避免材料上带上叶肉细胞。将撕下的洋葱内表皮平展在载玻片的HCl溶液中,水解5min;③用质量分数为1%的NaHCO3溶液反复清洗材料3次,直到材料下方不会产生气泡为止。清洗中应注意将材料中的气泡轻轻地驱赶出去,但不能损坏材料;④用吸水纸吸干载玻片上以及材料周围的液体;⑤滴1滴甲基绿吡罗红染色剂在材料上,染色5min;⑥盖上盖玻片,用显微镜观察。2.3实验中应注意的其他问题①在制作人的口腔上皮细胞临时装片时,用消毒牙签涂抹时要尽量将口腔上皮细胞涂抹开,防止细胞重叠;②以洋葱细胞为实验材料时,所撕取的材料要尽量大一些,以边长为0.5cm的正方形为宜,撕取的材料过小会影响实验结果;③经HCl水解后的洋葱内表皮,在用质量分数为1%的NaHCO3溶液清洗时,会在材料下产生一些气泡,应该尽量将气泡驱逐干净以免影响观察。在驱逐气泡时要注意动作要轻,不可损伤洋葱内表皮细胞;④用质量分数为1%的NaHCO3溶液清洗后的洋葱内表皮,要注意用吸水纸吸干材料周围的液体,若有残留液体存在则会影响染色的速度,易使染色现象不明显;⑤染色时间不宜过长,染色时间太长则会使细胞核颜色加深呈现深蓝色,易与细胞质颜色混淆;⑥实验时应该弃用洋葱最外层和最内层的几层鳞片叶,外层的鳞片叶所染颜色太深,而内层的颜色则太浅,都会影响实验结果。3．实验的改进在人教版普通高中课程标准实验教科书（必修）高中生物第一册中，“观察DNA和RNA在细胞中的分布”是一个新实验，实验要求学生把人的口腔上皮细胞制成临时装片，再用显微镜观察DNA和RNA在细胞中的分布。在实验教学过程中，笔者发现按照教材所述的实验步骤去操作，会给学生实验操作造成一些混乱，导致实验成功率不高。经过多次试验和摸索，笔者找到了改进的方法，获得了比较好的观察效果。笔者现将改进方法总结如下，以供同行参考。Ⅰ取口腔上皮细胞制片教材所述方法在制作口腔上皮细胞临时装片时，需要用到质量分数为0.9%的生理盐水，其作用是保持口腔上皮细胞的形态不变形。正确的配制生理盐水的方法应该是：称好溶剂NaCl的质量后，用蒸馏水溶解配制而成。但因受实验条件的限制，一些中学制备蒸馏水有困难，或因溶液配制量大，所需蒸馏水的量太大（另外，实验步骤三冲洗涂片也要蒸馏水），很多实验教师只好用自来水代替蒸馏水来配制生理盐水，这样配制的生理盐水的质量分数会大于0.9%，结果导致细胞皱缩，影响对细胞内DNA和RNA的观察。改进方法：不配制质量分数为0.9%的NaCl溶液，而是在制口腔上皮细胞临时装片时，在洁净的载玻片上直接滴一滴自来水，因为自来水里会含有Cl-，Fe3+等无机离子，不会使口腔上皮细胞马上皱缩或吸水膨胀。另外，在涂好材料后要马上到酒精灯上将涂有口腔上皮细胞的载玻片烘干，通过这样处理既可以获得满意的实验效果，又可以减少教师的工作强度。Ⅱ水解在制作口腔上皮细胞装片时，学生根据自己已经掌握的制作临时装片的方法，一般是在洁净的载玻片中央滴一滴清水，首先用消毒牙签在自己漱净的口腔内侧壁上轻轻地刮几下，然后把牙签上附有碎屑的一端放在上述载玻片上的液滴中涂抹几下，最后点燃酒精灯，将涂有口腔上皮细胞的载玻片烘干。这样操作，就会出现以下2个问题，从而影响下面实验步骤的进行。一是在洁净的载玻片上做好口腔上皮细胞临时装片后，几乎看不出材料的位置，后面的染色和观察就不便于操作；二是把口腔上皮细胞临时装片做在载玻片的中央，到下一步水解时，材料浸不到质量分数为8%的盐酸里。改进方法：在洁净的载玻片靠一端的地方用油性笔画一圆圈，在圆圈内完成临时装片的制作。Ⅱ冲洗涂片冲洗时，可以用自来水缓水流冲洗。Ⅴ染色染色时将吡罗红甲基绿染色剂滴2滴在载玻片上，染色5min，再用吸水纸吸去多余的染色剂，盖上盖玻片。这样操作，不仅染色时间太长，而且多余的染色剂也会沉淀在载玻片上，观察的时候，细胞颜色就会很深，从而影响对细胞内DNA和RNA的观察。改进方法：将吡罗红甲基绿染色剂滴2滴在载玻片上，染色时间缩短为2min，先用自来水缓水流冲洗一下，洗去浮色，再用吸水纸吸去载玻片上的水，盖上盖玻片，观察装片。笔者在教学实践中指导学生按改进的方法进行实验，效果非常好。