视网膜干细胞移植对青光眼视网膜神经节细胞的保护

中国组织工程研究第20卷第28期2016–07–01出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJuly1,2016Vol.20,No.28ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4203·研究原著·顾志敏，女，1979年生，江苏省响水县人，汉族，2003年东南大学医学院毕业，主治医师，主要从事眼睑、眼表疾病、眼整形方面的研究。中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)28-04203-07稿件接受：2016-05-19视网膜干细胞移植对青光眼视网膜神经节细胞的保护顾志敏，周利晓，齐若(郑州大学第五附属医院眼科，河南省郑州市450052)引用本文：顾志敏，周利晓，齐若.视网膜干细胞移植对青光眼视网膜神经节细胞的保护[J].中国组织工程研究，2016，20(28):4203-4209.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.015ORCID:0000-0002-7865-2063(顾志敏)文章快速阅读：文题释义：视网膜干细胞：是一种特殊的神经干细胞，视网膜Müller细胞是能够产生视网膜干细胞的惟一胶质细胞，大量研究表明Müller细胞是视网膜中的潜在视网膜干细胞，在视网膜神经节细胞缺失的兔眼中移植Müller细胞，可以分化为视网膜神经节祖细胞，促进视网膜神经节细胞功能的恢复。神经节细胞层：位于视网膜的最内层，由多极的节细胞组成，其树突主要与双极细胞联系，也可通过无足细胞横向联系，其轴突延伸至视神经乳头处，穿过筛板，形成视神经。摘要背景：干细胞移植是治疗致盲性眼病的一种新方法，关于视网膜干细胞移植对青光眼视网膜神经节细胞保护作用的研究不多。目的：探讨视网膜干细胞移植对青光眼大鼠视网膜神经节细胞的保护作用。方法：将45只SD大鼠随机分为3组(n=15)：对照组、模型组、视网膜干细胞移植组，后2组建立青光眼大鼠模型，视网膜干细胞移植组大鼠在建模后第7天向玻璃体腔内注射1mL视网膜干细胞(5×106个细胞)，模型组大鼠注射等量的PBS，对照组大鼠不予任何处理，移植2周后进行相关指标检测。结果与结论：①模型组脑源性神经营养因子和胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的表达均明显低于对照组(P0.05)，视网膜干细胞移植组脑源性神经营养因子和胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的表达明显高于模型组(P0.05)，但仍低于对照组(P0.05)；②模型组的视网膜神经节细胞的凋亡数明显高于对照组(P0.05)，视网膜干细胞移植组的视网膜神经节细胞的凋亡数明显低于模型组(P0.05)，但仍高于对照组(P0.05)；③模型组的视网膜神经节细胞数明显低于对照组(P0.05)，视网膜干细胞移植组的视网膜神经节细胞数明显高于模型组(P0.05)，但仍低于对照组(P0.05)；④结果表明，视网膜干细胞移植治疗大鼠青光眼可以保护视网膜神经节细胞。关键词：干细胞；移植；视网膜；青光眼；大鼠；神经节细胞；保护作用主题词：视网膜；干细胞移植；青光眼；视网膜神经节细胞；组织工程ProtectiveeffectofretinalstemcelltransplantationonretinalganglioncellsinglaucomaGuZhi-min,ZhouLi-xiao,QiRuo(DepartmentofOphthalmology,FifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,HenanProvince,China)视网膜干细胞移植对青光眼视网膜神经节细胞的保护视网膜干细胞青光眼大鼠模型视网膜脑源性神经营养因子、胰岛素样生长因子Ⅰ的表达明显增高，视网膜神经节细胞数明显增多，凋亡细胞数明显降低玻璃体腔内注射视网膜干细胞移植治疗青光眼可以保护视网膜神经节细胞顾志敏，等.视网膜干细胞移植对青光眼视网膜神经节细胞的保护P.O.Box10002,Shenyang110180:Stemcelltransplantationisanewmethodforblindingeyedisease.Butthereisalackofresearchabouttheprotectiveeffectofretinalstemcelltransplantationonretinalganglioncellsinglaucoma.OBJECTIVE:Toexploretheprotectiveeffectofretinalstemcelltransplantationonretinalganglioncellsofratswithglaucoma.METHODS:Forty-fiveSprague-Dawleyratswererandomlydividedintothreegroups(n=15pergroup)includingcontrol,modelandretinalstemcelltransplantationgroups.Ratmodelsofglaucomawerepreparedinthelattertwogroups,andat7daysaftermodeling,ratsinthethreegroupsweregivenintravitrealinjectionof1mLretinalstemcells(5x106cells),thesameamountofPBS,andnotreatment,respectively.Subsequently,relativeindicatorsweredetectedat2weeksaftertransplantation.RESULTSANDCONCLUSION:Theexpressionsofbrain-derivedneurotrophicfactorandinsulin-likegrowthfactorIproteinaswellasthenumberofretinalganglioncellswerethehighestinthecontrolgroup,followedbytheretinalstemcelltransplantationgroupmodelgroup,andthelowestinthemodelgroup(P0.05).Thenumberofapoptoticretinalganglioncellsinmodelgroupwassignificantlyhigherthanthatofcontrolgroup(P0.05),andwhichintheretinalstemcelltransplantationgroupwassignificantlylowerthanthatinthemodelgroup(P0.05),buthigherthanthatinthecontrolgroup(P0.05).Theseresultssuggestthatretinalstemcelltransplantationforratglaucomacanexertaprotectiveeffectonretinalganglioncells.Subjectheadings:Retina;StemCellTransplantation;Glaucoma;RetinalGanglionCells;TissueEngineeringCitethisarticle:GuZM,ZhouLX,QiR.Protectiveeffectofretinalstemcelltransplantationonretinalganglioncellsinglaucoma.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(28):4203-4209.0引言Introduction青光眼是一种致盲性眼科疾病，具有不可逆转性，主要是由眼内压增高等原因造成神经纤维层和视神经节细胞损伤后继发的一种神经系统变性病变，其发生由多种细胞因子共同参与。青光眼的治疗主要有改善微循环、诱导热休克蛋白表达、抗氧化、增加神经营养因子以及谷氨酸途径抑制剂等多种方法[1-2]，但上述方法不能有效阻止视网膜神经节细胞凋亡。干细胞具有自我更新和分化能力，将胚胎干细胞移植到小鼠视网膜内可以和视网膜层融合，分化为神经元细胞并提高其存活率[3]，研究表明移植到青光眼鼠体内的干细胞可以融合到视网膜中，分化为胶质细胞和视网膜神经元细胞，产生各种神经营养因子[4]。未分化的干细胞移植后可以产生化学因子受体和调节蛋白，并诱导Th1细胞凋亡，减少神经组织损伤，因此移植未分化干细胞可以治疗慢性神经系统疾病。青光眼的视觉功能异常主要是由视神经节细胞损伤引起的，因此找到一种能够分化为视神经节细胞并建立神经元功能联系的方法是治疗青光眼的一种途径。视网膜干细胞是存在于睫状边缘带的一种具有干细胞特性的细胞，可以分化为神经胶质细胞、光感受器细胞以及双极细胞等视网膜细胞，用于治疗视网膜变性疾病、老年性黄斑病变以及遗传性视网膜变性等致盲性眼科疾病。实验将分离和培养的视网膜干细胞用于移植治疗青光眼大鼠，观察青光眼大鼠视网膜中脑源性神经营养因子和胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白的表达、视网膜神经节细胞的凋亡情况以及视网膜神经节细胞的数量，为保护视网膜神经节细胞提供一种新的方法。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计随机对照动物实验。1.2时间及地点实验于2014年3月至2015年6月在郑州大学第五附属医院完成。1.3材料健康雄性SD大鼠48只，清洁级，8-10周龄，体质量190-220g，其中3只用于视网膜干细胞的培养，其余用于动物体内实验，所有大鼠购自河南省动物实验中心。实验前按实验动物饲养标准饲养于大鼠专用鼠笼，实验大鼠符合卫生部一级动物标准，经过动物伦理学委员会批准。1.4实验方法1.4.1视网膜干细胞的培养取3只8-10周龄大鼠，水合氯醛麻醉，摘下大鼠眼球，乙醇消毒，去掉眼球的视神经以及眼球外组织，分离出睫状体部组织，剪碎后置于离心管中，加入胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，胎牛血清终止消化，尼龙滤网过滤单细胞悬液，离心后弃去上清液，加入干细胞培养液进行培养。原代培养每3d进行1次半量换液，原代培养第3天时开始出现细胞球，第7天左右细胞球在瓶底融合，开始进行传代培养。顾志敏，等.视网膜干细胞移植对青光眼视网膜神经节细胞的保护ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4205视网膜干细胞的鉴定将原代培养的细胞置于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，培养第2天进行免疫荧光染色，PBS洗涤，多聚甲醛固定，PBS洗涤，TritonX-100作用，PBS洗涤，BSA封闭，一抗兔抗Nestin多克隆抗体孵育，阴性对照一抗用PBS替代，PBS洗涤后加入羊抗兔IgG-Cy3二抗，PBS孵育，DAPI复染，甘油封固剂封固，显微镜下拍照观察。取5个不同视野观察并计数染色阳性细胞，计算阳性细胞率，取平均值。1.4.3建立青光眼大鼠模型取8-10周龄SD大鼠30只，水合氯醛麻醉，双眼行布鲁卡因表面麻醉，将每只大鼠的左眼设置为实验眼，右眼设置为对照眼，测量每只眼的眼内压，激光对实验眼血管进行光凝，光凝后第7天及第21天测双眼眼内压，左眼眼内压比右眼眼内压升高大于10mmHg(1mmHg=0.133kPa)为青光眼模型建造成功