视网膜缺血性血管病变相关

视网膜内皮细胞的其他的可以激活caspase进而导致细胞凋亡的通路也被认为与视网膜缺血性血管病变相关。氧化压力是已知的可以通过使得线粒体释放细胞色素C而驱动细胞凋亡的。在注射了阿脲之后，大鼠表现出类似于链脲霉素导致的糖尿病的症状并且在视网膜中产生高水平的脂质过氧化物和高caspase-3的活性。在另外一方面，在饮食中添加抗氧化物可以减少这种高脂质过氧化物和高caspase-3的水平。就像在大鼠的视网膜中看到的现象一样，如果给予体外培养的牛视网膜细胞高浓度的葡糖糖，也会有相应的现象，并且也能被各种各样的抗氧化剂而缓解。这一结果独立地分别在人和牛的视网膜细胞中得以验证。而高血糖到底是通过怎样的途径而直接影响到细胞凋亡这在学术界还存在争论。而高纯度的人视网膜内皮细胞并不会因为暴露在高浓度的葡萄糖中而产生活性氧反应。不过，它们会在炎症反应的细胞因子（TNF-α和Il-1β）的作用下而产生上述反应，而其他的一些视网膜细胞比如Mueller细胞、视网膜色素上皮细胞会在高糖作用下而分泌这些细胞因子。当人视网膜内皮细胞和人Mueller细胞共培养并且暴露在高糖下时内皮细胞的caspase-3会被激活。这些现象与我们所观察到的当人视网膜内皮细胞被一般的促炎症因子--脂多糖所刺激时，其的caspase-3的表达会增加。在视网膜缺血性血管病变的大鼠的视网膜内皮细胞中的实验表明，不依赖于caspase的细胞凋亡途径（比如通过细胞凋亡诱导因子的直接作用）也有可能会发生。当这内皮细胞被暴露在过氧化氢中时，caspse-3会被激活。相较而言，将其表露在高浓度的葡萄糖或一氧化氮供体NOC-18时，会诱导细胞核形态发生变化，且通过annexinV指示的细胞凋亡会发生，不过caspase-3却没有被活化。当然，细胞凋亡诱导因子从线粒体向细胞核的转位有被观测到。自噬-溶酶体途径是细胞降解不重要的组分和存在因为各种生理、病理压力而有着潜在生存压力的情况下的一种生存策略。细胞内的囊泡—自噬小体能吞噬细胞器和蛋白并将之运到溶酶体进行立即的降解。低氧压力导致的细胞自噬在肿瘤病理学中已经被研究的很多了。那些因为低氧而产生的可以诱导细胞自噬的中介体比如Beclin1,BCL2/adenovirusE1B19kDaprotein-interactingprotein(BNIP)-3,microtubule-associatedproteinlightchain(MAPLC)-3,和autophagyrelatedgene(ATG)5在肿瘤细胞中被找到。依赖于HIF-1α和非依赖于HIF-1α的机制在肿瘤的生长过程中被认识。由于缺氧是人视网膜缺血性血管病变中的关键现象，我们研究了在缺氧情况下人视网膜内皮细胞产生自噬效应的能力。为了去证实人视网膜内皮细胞在低氧条件下是否会经历自噬，我们初步检测了下那些参与到溶酶体降解过程的基因。永生的人视网膜内皮细胞被培养在改进过的MCDB-131加入了2%FCS和内皮细胞生长因子的培养基中，再将之把暴露在1%的氧浓度环境下或者是室内空气中培养48小时。这之后，提取总的RNA后进行实时定量PCR检测。RT2ProfilerPCRArraySystem被用来检测84个与自噬相关的基因在低氧环境下的表达量的变化。与常氧相比，低氧处理后的人视网膜内皮细胞中VEGF165的表达水平显著地提高了6倍，这证实了低氧处理的细胞确实经历了低氧压力。经过5个管家基因(i.e.,β-2-microglobulin,hypoxanthinephosphoribosyltransferase1,ribosomalproteinL13a,glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,andβ-actin)的标准化，我们发现在人视网膜内皮细胞中有21个基因在低氧条件下被上调了，而11个基因在低氧条件下的表达量被下调了。不过只有4个基因(i.e.,CXCR4,CathepsinS,DNA-damageregulatedautophagymodulator1andtumornecrosisfactor)的上调超过了1.5倍，而下调的转录本包括了ATG3、ATG4A、ATG4C和ATG9B，而这些基因是参与到自噬小体的形成过程中的。虽然后续的实验需要从蛋白的水平去进行验证，不过我们的发现表明了人的视网膜内皮细胞激活自噬而适应压力的能力很有限。与之前发现的内皮细胞在早期糖尿病型视网膜病变的过程中的细胞凋亡比较而言，人视网膜内皮细胞对于在糖尿病中视网膜中的循环系统中的低氧情况可能特别的敏感性。8.未来的方向在将来，对于人视网膜内皮细胞的分子表型的阐述，特别是对于在疾病刺激的情况下的人视网膜内皮细胞的分子表型的阐述将会增加对于视网膜血管疾病的病理学上的理解。而分子生物学技术、分析软件、参考数据库等等的提升会使得在这领域的新兴研究成果得以出现。表达谱分析的方法给分子表型的确定提供了更全面的视野而值得被称赞，而这些分子表达谱的方法也为研究人员增加了解决问题的信心。但是，这之中的不协调的部分也在细胞生物学方面提出了新的假说。在多种系统中的研究提出来眼外的内皮细胞也能影响视网膜内皮细胞的可能。这包括了全基因组水平的甲基化测序来解释表观遗传学的影响；通过噬菌体展示技术来进行的配体受体筛查和通过光谱分析的方法来研究小分子代谢物的代谢组学等等。最接近我们研究的就是最近发展起来的RNA测序技术—也被称为是全转录本打靶测序—那很有可能在接下来5年的时间里逐渐代替转录本微芯片技术。尽管这一技术有众多的应用，其中最让人兴奋的应用是在鉴别和定量与可变剪切和单核苷酸多态性相关的转录本亚型或者被叫做全长转录本。这些方法都已经被用于眼外的内皮细胞研究中了，例如被用在了研究肺部的微血管在凝血酶作用下的基因表达情况。那篇文章的作者们在转录本水平发现了150个基因表达的上调和480个基因的下调，并且发现了1775个未知的转录本亚型。在很近的将来大家感兴趣的地方在于在视网膜内皮细胞的不同亚群中的分子表达谱。在眼中的血管内皮细胞和不在眼中的血管内皮细胞中的分子成分与表达量还是有很大差异的。在迄今为止的最大的内皮细胞表达谱研究中，从不同地方取来的动脉和静脉为实验材料，研究者们得到了817个静脉特异的基因和59个动脉特异的基因。而临床和实验研究也表明，这种多样性在眼睛里也类似存在。因为葡萄膜炎的病理学上的特点，参与此病的动脉和静脉的不同常作为临床诊断的依据。通过判断白细胞是否迁移到毛细血管后微静脉来鉴定的EAU病理模型的小鼠的研究，表明了在EAU发病初期的视网膜动脉和视网膜静脉在细胞粘附性相关分子的表达水平是不同的。从血管中把动脉分离出来的分子标记方法是基于ephrin-B2和EphB4分别的基本表达。这种区别在胎儿一开始的血管发生时期就出现了，而那时期正是这两种分子行使重要作用而决定血管命运的时候，且这种表达会一直持续到成年。其实毛细血管中也有这两种蛋白的表达，而建立了动漫、静脉相独立的微循环。我们通过免疫组化的方法验证了人视网膜内皮细胞中确实有一部分是ephrin-B2阳性的细胞，这与动脉血管相一致，而也有一些是ephrin-B2阴性的细胞，它们则代表了静脉血管。因此ephrin-B2的表达可以用来作为通过流式细胞仪从人视网膜内皮细胞中进行分离的标志物。并且，激光捕获显微切割技术也可以被用来从完整的视网膜上进行动脉血管和静脉血管的分离，随之进行的ephrin-B2的免疫检测可以确保下游的转录本组学和蛋白组学等试验的进行。关于视网膜血管缺血性疾病的治疗将是一种抑制病理机制的药物，但是对生理过程没有影响。虽然后葡萄膜炎和视网膜血管病变涉及多种细胞参与，视网膜内皮细胞是关键的参与者。因此，靶向针对视网膜内皮细胞将会证实治疗这一疾病的主要治疗方案。研究直接针对视网膜内皮细胞的治疗已经在动物模型中研究过。一个内皮素多聚体-人类Cdc6嵌合体的上游增强子在体外内皮细胞增生中提供了一个胰岛素样生长因子受体-1作用靶点。当在玻璃体内注射时，核糖酶可以减少OIR小鼠视网膜血管的数目及激光诱导的视网膜损伤，而没有负性调节正常的视网膜血管。通过带有GFP的杆状病毒载体控制血管内皮生长因子受体1启动子的表达表明在大鼠玻璃体内注射可以限制它的表达。这个系统还不能针对内皮产生治疗作用的蛋白，但是可以用于那个目的。然而，视网膜内皮细胞的分子组成与健康和疾病的相关联系为发展有效的生物疗法治疗后葡萄膜炎和视网膜血管缺血性变提供了强有力的基础。