第八章 植物基因工程

第八章植物的基因工程•植物育种已成为应用遗传学的一个非常重要的分支。传统的植物育种方法速度慢，且具不确定性。要引入一个或一套所需基因，传统的方法需要两系间的有性杂交，然后进行杂种后代与一亲本间的重复回交，直到植物获得所需性状。•重组DNA技术的出现突破了上述限制。植物遗传专家可将所需性状的基因(如抗虫害基因)克隆，并将此类基因引入到有价值的植物品种当中。第一节再生植株•一、植物在遗传工程方面的优缺点•１、优点•（１）、拥有在分子水平上可加以利用的大量植物品种，这些品种携带有遗传上各具特点的突变。•（２）、许多植物可自体受精，使其特别适合于遗传操作。当一具有某一突变的植物杂合子自体受精时，谱系中就包含了野生型植株、杂合型植株和含有突变的纯合型植株，这样突变就保留了下来。•（３）、植物可产生大量的后代，稀有突变体和重组体就得以保留。•（４）、可用可移动因子(transporsableelement)，它们可用作载体或作为插入诱变剂。•（５）、可利用植物的再生能力，可由单个细胞再生成一个完整的植株。•２、缺点•（１）、许多植物是多倍体，因而具有庞大的基因组。•（２）、组织培养的植物细胞由于多倍体的原因可能会引起体细胞克隆变异(somaclonalvariation)现象。•二、单个细胞可生长成完整植株•当植物受到机械损伤时，在损伤处将长出一片软细胞称作愈伤组织(callus)。若将一片幼嫩的愈伤组织取下并放置于含有适当营养成分和植物激素的培养基中培养，细胞将继续生长和分化成为悬浮培养物(悬浮在液体培养基中，含有单个细胞或小细胞团的培养物)。这些细胞取出后置于平板上，将形成新的愈伤组织。有时需要用其他细胞作为保育培养(nurseculture)，相似于用作哺乳类细胞培养中的细胞滋养层。然后愈伤组织会分化出根和茎，最后生长成一个完整的开花植株。•三、用叶盘再生植株•１、叶盘在含有土壤农癌杆菌的培养基中短暂培养后，叶盘边缘的细胞开始再生，这些细胞就充分暴露在转染剂中(图10—2)。•２、将叶盘转移至含有刺激茎枝发育的营养培养基中培养数日。•３、携带质粒的细胞通过刺激茎枝发育培养基中的适宜抗生素如卡那霉素加以选择。•４、茎枝发育几周后，可移至含刺激根生长的培养基中诱发根的形成。第二节植物基因转移的途径•一、土壤农杆菌法•土壤农癌杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)是一种革兰氏阴性菌，它的质粒转入植物之后导致植物产生冠瘿瘤(crowngall)。这个菌一般只侵染双子叶植物。•（一）、土壤农杆菌的Ti质粒引起冠瘿瘤•冠瘿瘤是由一些土壤农癌杆菌细菌在感染部位形成的植物肿瘤(图10－3)。•（二）、Ti质粒的T-DNA部分转移至植物•１、3种成分与Ti质粒肿瘤诱导有关(图10—4)。•（1）、T-DNA，它可转移至宿主细胞，是一种可移动因子。•（２）、vir基因(virulence的缩写)可产生转移活动蛋白，它对增强植物细胞的转化是必须的。•（３）、间接参与转化的基因，它们位于土壤农癌杆菌染色体上，负责将细菌细胞接合于植物上。•２、Ｔ－ＤＮＡ整合进植物染色体的机制•（１）、土壤农癌杆菌中的vir基因被植物细胞伤口产生的化学物质所开启(图10—4)。•（２）、Vir基因的活动，T-DNA因子脱离开质粒DNA。T-DNA两侧是Ｔi质粒序列，各25如长。这些傍侧序列称作边界(border)，它们参与T-DNA序列的切割。使T-DNA以单股链形式脱离。•（３）、T-DNA从细菌细胞到植物细胞的转移类似于细菌的接合过程，就像土壤农癌杆菌与植物细胞的交配。•（４）、多拷贝T-DNA以单个随机位点整合入植物染色体。•（三）、T-DNA经过改造后作为基因载体•一种称作共整合(cointegration)的方法最初用来与土壤农癌杆菌系统中的Ti质粒上的T-DNA一起进行基因转移(图10—5)。•1、把克隆的基因首先插入到含有T-DNA片段、且能够在大肠杆菌中复制的质粒克隆位点上。•２、将一中间穿梭质粒引入大肠杆菌细胞，通过在pBR322序列上编码的氨苄青霉素抗性基因选择转化子。•３、然后通过大肠杆菌和土壤农癌杆菌的交配特此质粒转移到土壤农癌杆菌细胞内。•４、两种质粒上的T-DNA序列发生同源重组，穿梭质粒（中间载体）整合入整合质粒（pＧＶ３８５０）。这一过程使穿梭质粒全部融入T-DNA的左右边界内。没有整合的质粒不会累积，因为它们不含土壤农癌杆菌的复制起点。•图11-5共整合载体克隆外源基因的过程双元载体系统•两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒，即微型Ti质粒和辅助Ti质粒。•微型Ti质粒是含有T-DNA边界，缺失Vir基因的Ti质粒，为一个广谱质粒，能够在大肠杆菌和农杆菌中进行复制。还含有选择标记基因。•辅助Ti质粒含有Vir区段，T-DNA缺失的突变型质粒，完全丧失了致瘤功能。图11-4用二元载体系统将多聚半乳糖醛酸酶的反义基因导入蕃茄细胞第三节植物外源基因的表达一、植物表达病毒的外壳蛋白、核酶和反义ＲＮＡ提高植物的抗病毒的能力。二、植物表达微生物毒素提高对昆虫的抗性三、物表达抗除草剂基因提高对除草剂的抗性四、植物表达不同影响花的颜色、形态和生长特性的基因产生新的花卉品种1、培育抗病毒作物•(1)、外壳蛋白介导的抗性•(2)、反义RNA介导的抗性•(3)、利用缺损的复制酶•(4)、干扰运动蛋白•(5)、卫星RNA介导的抗性•烟草花叶病毒(TMV)是一种6．5kb大小的RNA病毒。通过克隆病毒cDNA，发现该病毒基因组编码4种多肽：两种复制酶亚单位，一种外壳蛋白和一种与细胞间运动有关的重要蛋白。转基因植物在土壤农癌杆菌基因转移介质中将表达TMV的外壳蛋白(CP)(图10—11)。•2、培育抗虫植物•1、苏云金杆菌毒蛋白(Bttoxin)基因。•2、蛋白酶抑制剂(Proteinaseinhibitor)基因。•3、α淀粉酶抑制剂•4、外源凝聚素基因•通过对Bt毒素编码区域的部分修饰，并应用强启动子以增强Bt毒素mRNA的表达，使得Bt毒素能有效地翻译，借此保护棉花免受侵害(图10-12)。3、培育抗除草剂作物•除草剂草甘膦(glyphosate)是商用除草剂“围捕”(Roundup)的活性成分，它通过抑制5—烯醇丙酮莽草酸—3—磷酸合成酶(EPSPS)——一种生物合成必需芳香族氨基酸旁路中的叶绿体酶发挥作用。围捕是目前应用最广泛的除草剂。•5—烯醇丙酮莽草酸—3—磷酸合成酶(EPSPS)是细菌和植物芳香族氨基酸合成中的重要酶类，它的活性可被除草剂“围捕”中的活性成分草甘膦所抑制。将细菌编码草甘膦抗性的EPSPS基因克隆到T-DNA表达载体上，通过土壤农癌杆菌介导的基因转移，将其引入烟草细胞内。由于植物中的EPSPS合成于细胞质，而后转移至叶绿体，因此构建了一个嵌合基因，即将矮牵牛EPSPS基因中编码72个氨基酸的转移肽片段与细菌EPSPS编码序列的氨基末端相融合。嵌合基因的表达受花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子控制。转基因烟草既表达植物内源性EPSPS，又表达细菌草甘膦非敏感性酶。生化分析表明，转移肽将这种细菌酶正常地定位在叶绿体中。喷洒草甘膦后，野生型烟草由于EPSPS被抑制而死亡；而转基因植株由于细菌EPSPS在除草剂存在的情况下仍然发挥作用，因而其对草甘膦的耐受能力比死亡的野生型烟草要高出4倍。4、花卉基因工程•11.3.1利用基因工程改变花卉颜色•11.3.2利用基因工程改变花形和花期•将玉米编码的在花色素苷(一种使玉米粒成紫色的色素)形成途径中的酶的基因转移人矮牵牛。通过原生质体转化使cDNA转移入由于含有一个色素基因突变而表现为浅红花的矮牵牛品种细胞内。在15个再生植株中，两株为完全一样的砖红色花，4株表现部分砖红色花。•另一个实验是将蓝矮牵牛编码的蛋白质基因转移入玫瑰。玫瑰中从来没有蓝玫瑰，这是因为它缺乏合成蓝花色素的酶。现已将编码涉及生物合成蓝色色素——翠雀苷(delphinidium)的一种蛋白质基因从蓝矮牵牛中克隆。将这一基因转移入玫瑰中以产生蓝花转基因玫瑰的试验正在进行中。•5、利用转基因植物生产有重要价值的蛋白质•在各种植物中表达杂合蛋白仅仅停留在实验室试验的水平上。例如人的一种神经肽——脑啡肽(enkephalin)和人的血清蛋白已经在植物中表达。•植物基因工程另一潜在的应用是在植物中表达鼠的单克隆抗体。•植物基因工程另一潜在的应用是在植物中表达鼠的单克隆抗体。将来自老鼠克隆抗体中编码重链和轻链的克隆cDNA分别连接到T-DNA载体上，并置于组成型CaMV启动子的控制下。两种质粒通过土壤农癌杆菌感染分别转移入烟草细胞内。含有抗体重链和轻链基因的转基因植物杂交产生含有两种基因的植物后代。从其叶中抽提蛋白质，表明杂种植物中表达出了有功能的抗体分子。