第四章基因工程的主要技术及其原理(1)

第四章基因工程的主要技术及其原理生命科学学院第四章基因工程的主要技术及其原理第一节DNA和RNA的提取和纯化第二节凝胶电泳第三节核酸和蛋白质的分子杂交第四节聚合酶链式反应技术第五节DNA序列分析第六节基因定点诱变第七节DNA与蛋白质互作分析生命科学学院第一节DNA和RNA的提取和纯化核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。生命科学学院第一节DNA和RNA的提取和纯化核酸提取与纯化的原则保持核酸分子一级结构的完整性温度不要过高控制一定的pH值范围(pH值5-9)保持一定的离子强度减少物理因素对核酸降解的机械剪切力防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。生命科学学院第一节DNA和RNA的提取和纯化DNA酶抑制剂金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；阴离子型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。生命科学学院第一节DNA和RNA的提取和纯化RNA酶（RNAase)抑制剂RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。皂土（bentonite）作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。肝素复合硅酸盐（Macaloid)RNase阻抑蛋白（RNasin）氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)生命科学学院第一节DNA和RNA的提取和纯化RNA酶（RNAase)抑制剂DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。容易降解，保存在4℃或液氮中；提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。剧毒。生命科学学院第一节DNA和RNA的提取和纯化一般程序1、供体的核酸分离供体细胞培养收集(菌体)细胞细胞破碎分离总DNA分离细胞器分离总RNA分离细胞器DNARNApoly(A)RNA特异性RNA染色体DNA(组建基因组文库)生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法DNA提取的几种方法基因组DNA的提取CTAB法SDS法其它非基因组DNA的提取质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-SDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法DNA提取缓冲液组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法硅质材料:高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。阴离子交换树脂:低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁珠:磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法基因组DNA-其它方法根据核酸分离纯化方式的不同有：浓盐法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液碱裂解法流程图生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法(溶液配方)SolutionⅠ50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris.·Cl(pH8.0)、10mmol/LEDTA(pH8.0)高压灭菌后，4℃保存备用。SolutionⅡ(现用现配制)0.2mol/LNaOH、1%SDSSolutionⅢ（100ml）5mol/LKAc60ml、冰醋酸11.5ml、水28.5ml配制成的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸（pH4.8）。生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法所用试剂的生化作用溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌作用。葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用,同时有利于溶菌酶的作用。生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法所用试剂的生化作用NaOH-SDS液:NaOH浓度为0.2mol/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成为R一O－S03-…R+一蛋白质的复合物,使蛋白质变性沉淀下来。生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法所用试剂的生化作用KAc:pH4.8的KAc溶液是为了把pHl2.6的抽提液调节至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。高盐3mol/LKAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物的凝聚而沉淀。染色体DNA因为中和了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与RNA、SDS-蛋白复合物作用后，形成钾盐形式复合物，使沉淀更完全。生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法所用试剂的生化作用无水乙醇:沉淀DNA，它的优点是可以任意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。酚-氯仿:酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－碱裂解法所用试剂的生化作用异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法质粒DNA－煮沸法原理：染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法细胞器DNA－差速离心法线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中DNA提取的基本步骤生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）材料准备生命科学学院一、DNA提取的基本原理与方法细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，