第四讲基因工程

第四章基因工程基因工程定义常用工具酶载体一、基因工程定义1.定义基因工程是指将外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。2.基因工程核心技术：DNA克隆技术（又称为DNA重组技术、分子克隆技术）具体过程：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体）。基因克隆的技术路线基因载体体外重组重组子（杂合DNA）转化受体细胞筛选阳性克隆大量扩增，获得子代DNA•基因克隆示意图目的基因载体DNA(限制性内切酶切开)重组体宿主细胞已转化的宿主细胞繁殖阳性克隆株表达（蛋白质）3.基因工程要件工具酶（限制性内切酶、连接酶、聚合酶等）目的基因（外源基因）载体（质粒、噬菌体DNA等）受体细胞（大肠杆菌、酵母菌、动物细胞等）基因工程、遗传工程、基因操作、重组DNA技术、基因克隆、分子克隆重组DNA技术进展1973Cohen第一例成功的克隆实验1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼•1993基因工程西红柿在美国上市•生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、发酵工程。其中基因工程是核心。•胰岛素•人生长激素•干扰素•白细胞介素2•粒细胞集落刺激因子•粒细胞巨噬细胞集落刺激因子•红细胞生成素EPO•组织纤溶酶原激活剂•生长激素•促生长素•抗血友病因子Ⅷ•脱氧核糖核酸酶•葡糖脑苷脂酶•鼠单克隆抗体4.基因工程与医学的关系分子医学molecularmedicine（1）疾病基因的发现（2）发展生物制药基因工程药物基因工程疫苗（3）DNA诊断基因诊断基因诊断—用分子生物学的技术对引起疾病的原因--遗传基因,致病微生物和寄生虫,以及某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞遗传基因的检测和分析.DNA/RNA（4）基因治疗genetherapy—就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。1.基因置换2.基因修正3.基因修饰产物补偿缺陷细胞4.基因失活反义技术封闭基因,抑制有害基因对象体细胞生殖细胞1990.9.14首例基因治疗4岁女孩严重免疫缺陷症(SCID)缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA)2--脱氧腺苷含量升高毒性严重破坏免疫功能治疗：ADA基因LN逆转录病毒载体靶细胞为病人淋巴细胞回输截止1996年6月，世界上接受体细胞基因疗法的患者已达1537例，说明体细胞基因治疗的技术路线具有较大的可操作性。杰辛格事件1999年公布：18岁的亚利桑那州高中毕业生泽西·杰辛格因患鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OTC）部分缺陷症在宾夕法尼亚大学接受基因治疗。该校基因治疗研究所的研究者采用导管经腹股沟动脉直及肝血管，将携带校正基因的重组腺病毒导入肝脏，外源基因的表达可望校正OTC缺陷所导致的高血氨症。基因治疗4天后，杰辛格出现发烧、凝血而死亡。二、基因工程常用工具酶•常用的工具酶：限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基一把特殊的剪刀——限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖（一）限制性内切酶1.作用：识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键2.命名：–EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)(Escherichiacoli大肠杆菌）3.分类：Ⅰ型:识别特定位点，随意切割。Ⅱ型：识别特定位点，并在位点内切割（应用最广泛）Ⅲ型:识别特定位点，附近切割。核酸的结构•4.识别和切割位点特点–回文结构4～8bp–产生两种末端粘性末端粘端平头末端平端如：GGATCCCCTAGGEcoRⅠGAATTCCTTAAG5′3′5′3′5′GCTTAAAATTCG3′3′5′粘性末端SmaⅠCCCGGGGGGCCC5′3′3′5′5′CCCGGGGGGCCC3′3′5′平头末端粘性末端与平头末端续表续表pBR322EcoRⅠHindⅢBamHⅠAvaⅠPvuⅡSalⅠPstⅠOri氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因DNA酶切消化与电泳分析•同工异源酶：来源不同但能识别和切割同一位点•同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶,它们切割DNA分子后都形成GATC四个核苷酸形成的粘性末端。同尾酶DNA上的酶切位点pUC18与pUC19的多克隆位点序列5、影响限制性核酸内切酶消化的因素•DNA的纯度•DNA甲基化程度•温度•缓冲液：Mg2+（二）DNA连接酶1.功能：催化DNA双链5‘磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。2.种类：T4DNA连接酶、细菌DNA连接酶。3.作用温度：最适37℃，通常16℃左右。•DNA聚合酶•TaqDNA聚合酶•逆转录酶•碱性磷酸酶•末端脱氧核苷酰转移酶（三）修饰酶1。DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)的活性•5′→3′的聚合活性–5′→3′方向•核酸外切酶活性–5′→3′外切酶活性–3′→5′外切酶活性•polⅠ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段–大片段（Klenow片段）：聚合活性、3′→5′外切活性常用的工具酶用于测序、探针标记等。2。TaqDNA聚合酶：耐高温，具有聚合及3′→5′外切酶活性。常用于PCR扩增。三、基因工程载体（一）定义：能将有用基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的遗传因子。即：能携带靶DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。其本质是DNA。（二）理想克隆载体的条件•能自主复制和增殖•易进入宿主细胞•有合适的酶切位点方便组装外源DNA•具有筛选标志和识别指标（三）种类：•质粒•噬菌体DNA•病毒DNA1.质粒载体•质粒——细菌染色体以外的，能自主复制的，与细菌共生的，同时对细菌的表型有一定影响的遗传物质。•特点——双链环形严紧复制或松弛复制对宿主存活不必需人工质粒载体严紧型质粒载体松弛型质粒载体•类型：天然质粒载体例1pBR322pBR322EcoRⅠHindⅢBamHⅠAvaⅠPvuⅡSalⅠPstⅠOri氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因特点：分子小，松弛型含常用酶切单切点有Ampr和Tcr抗性基因作为筛选标记例2pUC18（多克隆位点）pUC18与pUC19的多克隆位点（多种酶切口、单一酶切点）序列2、λ噬菌体载体•结构特点a、线性双链DNA分子，b、其末端有12bp的互补单链，称为cos位点，是λDNA包装成为噬菌体颗粒不可缺少的序列。野生型λ噬菌体的cos位点序列为：——CCCGCCGCTGGA5′5′GGGCGGCGACCT——•λ噬菌体(λphage)–基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区–DNA，替换型载体，外源DNA：9~23kb–常用：EMBL系列、λgt系列、charon系列•科斯质粒(cosmid)：λDNA的cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：40~50kb常用的噬菌体载体3、真核基因病毒载体•SV40病毒•牛乳头瘤病毒•腺病毒4.酵母人工染色体载体(YAC)•YAC(yeastartificialchromosome)载体是大容量的载体，可供插入的外源基因片段长度是200～1000kb，甚至更长。YAC已经成为人类基因组研究中的重要工具。哈哈，下课了!