胚胎干细胞在现代生物技术中的研究与应用

胚胎干细胞在现代生物技术中的研究与应用摘要：通过对胚胎干细胞的培养与建系；全能性或多能性的鉴定；基因组操作以及在嵌合体应用中的意义，全面阐述了胚胎干细胞的本质特殊性征是全能性或多能性的。同时笔者就胚胎干细胞应用前景进行了论述，即：生产纯合基因动物；生产嵌合体动物；为遗传工程提供理想的受体材料以及研究细胞分化等诸多方面的应用。关键词：胚胎干细胞；现代生物技术；转基因动物；细胞全能性；嵌合体中图分类号：Q813文献标识码：A文章顺序编号：1001-1642（2003）05-0011-03胚胎干细胞（Embryonicstemcell），简称ES细胞，是从早期胚胎的内细胞团（ICM）或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的细胞，它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能。1981年分别由英国剑桥大学的Evans和Kaufman及美国华盛顿大学的Martin首先建立，早期又称为EK细胞或ESC。ES细胞像其它细胞一样，可在体外培养、扩增、克隆、冷冻，并且人们可对其进行遗传操作和选择。其本质特征是全能性或多能性。目前为止，已成功建立了小鼠ES细胞系，其它动物如仓鼠、猪、牛、兔以及人类仅分离和建立了类ES细胞系。1小鼠ES细胞的培养与建系ES细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能，但在体外极易分化，需培养在饲养层细胞上或含白血病抑制因子的培养基中才能维持其生长和抑制其分化。ES细胞多向分化潜能是ES细胞育种的前提，因此ES细胞的体外培养要解决的关键问题是维持细胞的分裂增殖和抑制其分化。大量研究表明，用胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养基DMEM中加白血病抑制因子的方法是分离培养ES细胞最普遍使用而且有效的方法。从囊胚中分离内细胞团，分散种植于饲养层细胞上，2－3d就开始出现ES细胞集落，这种集落的细胞比较小，有1个大的核和1－2个核仁，细胞间排列十分紧密，是未分化状态，3－5d就可以进行分离培养。5－8d后再进行分离和培养，经过若干次分离再培养和扩增后即可进行正常的传代与冻存。2ES细胞全能性或多能性的鉴定由于ES细胞的发育全能性或多能性是人们研究和应用它的根本原因和基础之一，所以在全能性或多能性的检测方面人们积累了包括形态学鉴定、原核注射技术、胚胎嵌合体技术、ES细胞核移植技术和免疫学鉴定等多种方法。其中免疫学鉴定是比较直接和可靠的方法。其原理是：ES细胞保持着早期胚胎末分化的特性，其表面含有丰富的AKP及胚胎阶段特异性抗原，采用AKP染色或SSEA免疫荧光标记，ES细胞均表现为阳性反应吸。3ES细胞基因组操作ES细胞基因组操作的关键是把外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不影响ES细胞的各种功能。这就要求目的基因定点参入、整合后，对原有基因结构及功能没有影响或影响最小。3．1对基因组操作正确的ES细胞的筛选人们已设计出能够使目的基因定位整合的特殊载体，通过正负选择方法把富集正确整合的ES细胞选择出来。适于正负选择法的载体通常包含以下几部分：与整合位点两端区域同源的两段DNA序列（HB1和HB2）、转入的目的基因（TG）、编码抗G418的新霉素磷酸转移酶基因（neor）和2个不同的胸苷激酶基因（HSV－tk1和HSV－tk2）。这几部分结构的序列排列对于正负选择法起关键作用。转入基因（TG）与G418抗性基因（neor）位于HB1和HB2之间，在外边两侧分别为HSV－thl和HSV一tk2。如果发生错误整合，那么这2个HSV－tk中至少会有一个可能与其他序列一起整合，而如果发生正确的同源重组而整合，那么HSV一tk就不会整合到基因组中，只有转入基因及neor整合进入基因组中。因此用G418来筛选转染细胞，没有整合neor基因的细胞将全部死亡，整合了外源基因的细胞就可以存活下来，这是正选择。如果在加入G418的同时再加入化合物9一鸟嘌吟，那么表达了胸苷激酶的细胞就会被杀死。因为胸苷激酶能把9一鸟嘌吟转化成有毒的化合物，使细胞死亡，这是负选择。能在正负双重选择下存活下来的细胞就是DNA整合到正确位点的细胞。要检测ES细胞中外源DNA是否整合到染色体的正确位点，还有一个更为直接的方法——PCR法。使用PCR法时，在DNA载体中的HB1和HB2序列之间，加上一个载体和鼠的基因组中都没有的独特DNA序列（US）。转染ES细胞以后，就可以对细胞进行PCR检测了。引物P1与独特序列US互补；引物P2则与染色体上的一段邻近序列互补。如果发生随机整合，PCR就无法扩增出预计大小的DNA片段；如果整合于特异位点时，就可以扩增出一条已知大小的DNA片段。采用这种方法人们可以方便快捷地检测出目标位点整合了转入基因的ES细胞。这些细胞进行传代培养后，就可以建立携带正确的转入基因的细胞系了。PCR方法可以对少量细胞进行鉴定，且不用药物处理，对细胞的影响较小，这种方法较好。但是由于它必须对每个细胞的DNA进行扩增，分别检测，所以用于同源重组率低的细胞筛选时工作量太大，故适用于重组率高的实验检测。3．2ES细胞的基因转化1985年，Wagner等首次使用逆转录病毒载体MMCV－neo感染ES细胞，用G418筛选。用转化细胞制成嵌合鼠，在各分化组织中均有neo基因的表达。同年，Lovell-Badge等将人类Ⅱ型胶原基因导入ES细胞。在得到的嵌合鼠中，所有组织均探测到人类Ⅱ型胶原基因的存在，而且在胎儿的“非软组织”中有一定程度的表达。1986年，Robertson等人使用MPSVmos-1neo逆转录病毒载体转化ES细胞后达到了种系传递，首次证明了通过ES细胞途径得到转基因动物的可行性。3．3ES细胞的基因突变3．3．1利用逆转录病毒载体造成插入突变用逆转录病毒载体感染ES细胞，当它刚好插入在发育中起重要作用的基因时，将转化的ES细胞导入种系后，在产生的后代中导致发育上的缺陷，甚至死亡。通过对胚胎的跟踪研究就可以发现被突变基因的作用方式，以插入片断为探针又可以调出相应的基因片断进行结构分析及进一步操作。近期，由于报告基因的应用，利用ES细胞进行发育遗传学研究更进了一步。将报告基因克隆到病毒载体上，构成“诱捕载体”，转染ES细胞后制成嵌合体。用切片染色等手段可以发现，插入片段所“诱捕”到的启动子或增强子在表达时间及空间上的特性。再以报告基因片段为探针，便可找到相应的内源片段，进行分子水平上的完整工作。因而，这一方法使发育调节机制的研究进入了一个新的阶段。3．3．2通过同源重组定位突变内源基因利用ES细胞途径，不仅可以达到上述的“指示”作用，更重要的是与基因的定位整合技术相结合后产生“创造”作用。这一技术最终确立了ES细胞在哺乳动物遗传工程领域内不可替代的重要地位。实验表明，不仅染色体之间可以重组，体外克隆的DNA进入细胞后也可以与同源的染色体DNA发生重组，其结果是外源DNA定位地进入染色体上的同源部位。基因打靶就是利用了同源重组的原理，将外源DNA稳定地插入预期的位点。通过同源重组，还可以实现特定内源基因的定向敲除。4ES细胞在嵌合体应用中的意义1961年，Tarkowski报道了将不同品系的卵裂阶段的细胞经聚合后形成嵌合体。1974年，Brinster发表了将体外培养的小鼠畸胎癌干细胞注入囊胚并形成嵌合鼠的初步报道。这些工作给人们很大的启迪，人们设想，如果将目的基因导入EC（Embryonalcarinomacell）细胞，经过囊胚注射而产生嵌合体，并且转化的EC细胞参与嵌合体种系生殖细胞的建成，就可以将目的基因传给下一代。这是一条十分诱人的路线，最大的优点是可以在体外对细胞进行遗传操作和筛选。然而这一路线在实际工作中遇到了严重的问题，大多数EC细胞系都不能参与嵌合鼠生殖细胞的形成，其原因是EC细胞的染色体是异常的。此外，EC细胞具有肿瘤原性，常在嵌合体中形成肿瘤或导致胚胎的早期死亡。ES细胞的建立使这一路线的可行性成为现实。ES细胞来自于正常的小鼠胚胎，具有正常胚胎干细胞的特性和特征，具有高效的形成嵌合鼠的能力，并可直接参与嵌合鼠生殖细胞的形成。ES细胞建立后，经过10年的努力，人们的思路逐渐清晰，结合体细胞遗传学和遗传工程技术可将外源基因转化ES细胞获得适位整合，满意表达和稳定转化的细胞系；也可通过同源重组的方法造成基因突变和基因分子水平上的改造，通过这些基因操作后，再经过嵌合体途径使改造过的ES细胞分化发育为生殖细胞，在某些情况下，雄性嵌合体的精子全部是由ES细胞形成的。进而可以得到转基因动物或按人们设计的方案改造基因的动物个体，这就形成了一条哺乳动物遗传工程ES细胞途径。5胚胎干细胞应用前景展望5．1生产纯合基因型动物高等哺乳动物一般通过有性繁殖产生后代，其周期长，产仔数少，对于优良个体的迅速繁衍有很大局限性，尤其对于特别优秀的个体或特殊用途的需要纯合基因型的个体，利用两性繁殖方式，短期内很难使多个位点的基因同时纯合。利用ES细胞通过核移植方式可在短期内获得基因型及表型完全相同的个体。、这种方法为动物育种及珍稀遗传资源的保护和恢复提供了新途径。5．2生产嵌合体动物将ES细胞注入受精卵内，或将ES细胞与早期胚胎共同培养形成嵌合胚，再通过胚胎移植产生嵌合体动物，以获得新的性状。例如，异种动物的嵌合体，可以克服免疫排斥反应，为人类器官移植提供实验材料。5．3为遗传工程提供理想的受体材料人类可对ES细胞进行遗传操作和选择，这为利用基因工程改造生物提供了独特的无与伦比的受体细胞。利用ES细胞技术和同源重组定位整合技术，就可产生转基因ES细胞。通过药物选择及培养基选择和细胞水平与代谢物的检测，筛选出携带目的基因的ES细胞。通过该细胞核移植，获得真正的转基因动物，以提高遗传工程的效率。5．4为发育遗传研究提供实验材料研究发育突变体需要纯合子型的实验材料，从同源型胚胎建立的多个干细胞突变株可满足此条件。将同源于细胞突变株在体外培养，研究它们对发育刺激信号的反应能力，也可将突变干细胞注入囊胚中产生嵌合体，研究其分化潜能，从而揭示突变基因在发育过程中的作用。将外源DNA导入ES细胞，研究外源基因在发育中的作用。例如，用这种方法可以探讨外源基因是在特异阶段表达还是特异组织表达等问题。如果能建立人类遗传性疾病有关基因的嵌合体模型，研究外源基因在个体发育中的作用，这将为人类遗传病的治疗提供新的技术。5．5研究细胞分化利用ES细胞研究饲养层抑制细胞分化的生理机制。条件培养基对ES细胞的分化具有可逆性抑制，但不损害ES细胞的多能性或全能性。研究发现，ES细胞含有较高的LIF受体（190－300个／细胞），这是其在LIF存在时保持末分化状态的基础。研究LIF及其它生长因子对ES细胞分化作用以揭示抑制细胞分化的机制，对于阐明细胞分化程序的调节机制具有十分重要的意义。