脂质过氧化及抗氧化剂抗氧化活性的检测方法

1脂质过氧化及抗氧化剂抗氧化活性的检测方法摘要：越来越多的研究表明，很多疾病和衰老现象都与脂质过氧化有关。本文对近年来脂质过氧化与抗氧化剂抗氧化活性的检测方法作简单综述，包括气相色谱、液相色谱、质谱、化学发光法等，并对不同方法进行了综合比较与评价。各种检测技术的对象各有不同，而且各有优缺点。因此，要针对不同的实验目的及条件来选择不同的检测方法。关键词：脂质过氧化；抗氧化剂；抗氧化活性；检测LipidsperoxidationandtheDetectionMethodsofAntioxidantactivitiesofAntioxidantsAbstractLipidperoxidationhasreceivedconsiderableattentionbecauseofitspossiblecontributiontothepotentialdamageofbiologicalsystems.Thestudyonthemechanismandtheprotectionoflipidperoxidationareconcernedtoourlivingandhealth.Lipidsperoxidationandthemethodsofdeterminationofperoxidationandantioxidantactivitiesinbiologicalsystemswerereviewed,includingGaschromatography,LiquidChromatography,MS,Chemiluminescenceandsoon.Differentmethodsarecomparedcomprehensivelyandevaluated.Avarietyofdetectiontechnologieshavedifferenttargetclientele,butalsohavetheirownadvantagesanddisadvantages.Therefore,itisnecessaryfordifferentexperimentalpurposesandconditionstochooseadifferentdetectionmethod.Keyword:lipidperoxidation,antioxidant,antioxidantactivity,detection在生物体内，很多脂类含有高不饱和脂肪酸，特别在生物膜的磷脂中，高不饱和脂肪酸含量极高。由于不饱和脂肪酸双键电子云密度大，化学性质很不稳定，很容易受到过氧化作用的损伤，产生有细胞毒性的脂质过氧化物。这些化合物能破坏人体细胞正常的生理功能，促使人体衰老和诱发癌症。目前，国内外关于氧化应激、自由基损伤和生物抗氧化的研究主要集中在食品、化妆品、生理学、流行病学和医学等领域，从分子水平上研究其作用机理、基元反应和结构/活性关系的工作尚不多见，许多基础理论问题尚待解决。因此，脂质过氧化的检测方法在反应机理的研究中就显得尤为重要。各种抗氧化物质抗氧化作用的强弱取决于其抗氧化的能力（或称抗氧化活性，AntioxidantActivity）。抗氧化能力的测定方法有许多种，有直接的，也有间接的，还有简便的总抗氧化能力（TAC）试剂盒等。这些方法都有一定的优缺点或局限性（或专用性），测定原理也各不相同。因此，为获得准确的评价结论，还需综合评估各种方法，以获得满意的结果[1]。1脂质过氧化反应的机理脂质过氧化作用(LipidPeroxidation)是自由基生物学的一个分支，是指脂类（RH）的多不饱和脂肪酸（PUFA）与自由基反应，形成中间体自由基，再与分子氧形成脂质过氧化自由基，引起酸败变形[2]。生物膜的脂质中含有较多的多烯不饱和脂肪酸，易发生脂质过氧化而损伤膜的功能与结构。正常生命过程产生的自由基是维持生命所必须，但若浓度过高则对2机体有害。体内自由基的产生与清除处于动态平衡中，一旦平衡破坏就危害机体。环境中有多种因素促使自由基的产生，引起脂质过氧化，例如电离辐射、紫外线、臭氧、废气、杀虫剂、除草剂、光敏剂及金属离子等等[3]。自由基是指一类可以独立存在的含有未配对电子的物质，包括分子、原子、原子团或离子。若这类物质含有不配对电子的含氧基团称为氧自由基（OxyenFreeRadicais,OFR），主要包括超氧阴离子自由基（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（HO•）、单线态氧（1O2）等。这些不成对的电子使OFR具有不稳定性和高反应活性[4、5]。脂质过氧化过程是一个产生自由基和自由基参于的链式反应，可分为三个阶段：1.1诱导阶段（Inductionstep）RH→→R•+H•1.2传播阶段(Propagationstep)R•+O2→→ROO•ROO•+RH→→ROOH+R•生成的ROOH很容易发生各式各样的分解反应，例如：ROOH→→RO•+HO•RO•和HO•都是非常活泼的自由基，与RH起反应均能生成R•：RO•+RH→→ROH+R•HO•+RH→→H2O+R•1.3终止阶段(Terminationstep)各种自由基在量的增加后相互结合，链式反应终止：R•+R•→→RRROO•+R•→→ROORROO•+ROO•→→ROOR+O2式中的RH为参加反应的油脂中的不饱和底物，H是邻近双键两旁的亚甲基上的氢原子。反应过程中产生的R•、ROO•、RO•及HO•等自由基均可以由自旋共振仪测定。2脂质过氧化的检测2.1脂质过氧化底物的检测2.1.1氧耗不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的过程伴随有氧气的消耗，因此氧耗也成为检测脂质过氧化的指标之一，氧耗的测定可采用Wills测压法及氧电极法，后者较为常用。而且此法只需一个氧电极即可，利用氧电极可以很方便的测量溶液中的氧浓度，因此，可以用它检测一个反应体系中的氧消耗以研究自由基产生的动力学过程。氧气吸收的量用电子电位差计记录，它还可以连续检测脂质过氧化的进程，但体系必须是封闭的。最近，又发展起来一种自旋探针测氧法，它是利用自旋探针ESR波谱的超精细结构随氧浓度改变来测量一个反应体系中氧浓度的方法。氧气是一个顺磁性的三重态分子，它可以和自旋探针的未成对电子产生自旋相互作用，使自旋探针的ESR波谱产生自旋-自旋增宽，使本来存在的一些超精细结构无法分辨。利用超精细结构随氧气浓度的改变就可以测量该体系中浓度和氧的消耗。但利用这一方法测量生物体系氧消耗的时间不能太长，也不能有氧化还原反应。2.1.2增重法脂质过氧化过程中必定要吸收一定的氧，底物吸氧后形成过氧化物增重。通过对氧化混合物作NMR分析，由乙烯基质子峰面积可以得出不饱和脂肪酸氧化随时间变化的情况。此法只适用于常温下的反应，且底物体系中无易挥发的物质。32.2脂质过氧化产物的检测2.2.1脂自由基在脂质过氧化进程中会产生许多自由基如R•、ROO•、RO•、HO•等，这些自由基含有一个未成对电子，这就决定了具有顺磁性和很高的反应活性。所有检测自由基的方法都是根据自由基这两个特性发展起来的，这些方法可分为物理方法和化学方法两大类。所有检测自由基的方法原则上都可以检测氧自由基。但氧自由基具有它自己的特性，所以还有一些检测氧自由基的特殊方法。电子自旋共振(electronspinresonance,ESR)，又称电子顺磁共振（electronparamagneticreonance,EPR），是检测自由基最直接和最有效的方法。根据共振条件hv=gβH，一个ESR波谱仪就是一套用来测量自由基时要满足这个共振条件的设备。一般ESR波谱仪都是固定频率，通过改变磁场来满足共振条件，因此，称为扫场式。由于高频微波热效应很大，特别对含水样品，水对微波吸收很厉害，所以，一般高频ESR波谱仪不能测量活体中的自由基。最近发展起来的低频L波段ESR波谱仪解决了这一问题，一是热效应低，二是样品腔大，可以容纳大体积样品，甚至活体动物。近年来发展起来的自旋捕集技术具有更广的应用空间。所谓自旋捕集技术就是为了检测和辨认短寿命自由基，将一种不饱和的抗磁性物质（称自旋捕集剂，一般为氨酮和亚硝基化合物）加入要研究的反应体系，生成寿命较长的自旋加合物，可以用ESR检测：自旋捕集剂+R•→→自旋加合物最常用的自旋捕集剂是tNB(nitrosotert-butane)、DMPO(5,5-dimethyl-pyrroline-1-oxide)和PBN(phenyl-tert-butynitrone)，它们和自由基反应都可以生成氮氧自由基，所得ESR波谱的一级分裂都是氮原子引起的三重分裂，这一点和自旋标记所得到的ESR波谱很类似。但是，自旋加合物的ESR波谱常常被分裂为二、三级更复杂的图谱，由二、三级分裂峰制得的数目和强度可以推导出捕捉到自由基的结构和性质。2.2.2共轭二烯氢过氧化物（CDHP）不饱和脂肪酸的侧链氧化过程中伴随有CDHP的生成，该共轭二烯结构在紫外区234nm附近具有很强的特征吸收，因此可以利用这一特征对脂质过氧化进行检测。该法操作简单，用一个简单的紫外分光光度计即可。该法适用于检测纯度较高的脂质过氧化反应，因为反应体系中的其他底物也可能在这个波长范围内有吸收。另一个误差来源于脂肪酸本身在紫外区（210nm）的吸收和CDHP（234nm）的吸收只差20nm，并且CDHP本身也是一个不稳定的化合物。因此，CDHP含量的多少不能准确反映脂质过氧化的程度，它只能部分地反映氧化初始阶段脂质过氧化的程度。2.3脂质过氧化降解产物的检测脂质过氧化物很不稳定，可自发降解成小分子的复杂产物，如醛、酮、烷烃、烯烃、酸及聚合物等。对这些降解产物的检测被认为是最能有效的反映脂质过氧化的水平。其中丙二醛（MDA）是脂质过氧化的最典型的终产物。2.3.1化学发光法(CL)发光是处于高能激发态的分子或原子向基态跃迁时，发射光子的现象。化学发光法是由化学反应引发的，发射光可以是紫光、可见或近红外光。能产生发光反应的化合物（有机物或无机物）很多，典型的反应可以表示为：（※表示激发态）A+B→→C※+DC※→→C+光化学发光法中，常用一些发光增强剂来提高检测的灵敏度，常用试剂有鲁米诺(luminal)、洛粉碱(luphine)、光泽精(lucigenin)和过氧物(peroxyoxadate)等。化学发光的测定最大优点是不需要对反应体系加热，因为即使在室温条件下反应的速度也是非常快的。将HPLC分离与化学发光法联用，可以使检测限达到皮摩尔级。采用HPLC4柱后，检测技术还克服了HPLC受抗氧化剂干扰的缺点，从而可以通过测定保留时间来鉴定脂质氢过氧化物的性质。0.01nm的脂质过氧化物很容易检出，反相液相色谱能使氢过氧化物得到很好的分离。化学发光法有灵敏度高、安全性好、适用范围广、发射率易控制等优点，故已在分析化学中得到广泛应用，但它也存在着有些反应观察时间长、重现性差的缺点。烃和脂质被氧化时会发光，这与氧化过程中不同步骤产生的自由基有关。化学发光的强度越大通常说明氧化程度也就是脂质酸败的程度越大。该法已用于测定豆油、方便面、奶粉和菜籽油等的氧化程度，亦可用于水产品脂质过氧化的检测[6]。2.3.2荧光法脂质过氧化产生的羰基化合物如丙二醛（MDA）可以和蛋白质、氨基酸反应生成含有N-C=C-C=N结构并发荧光的烯夫碱（Schiffbase）。此碱具有典型的荧光激发光谱和发射光谱光谱（420-470nm）。因此，用荧光分光光度计测定其荧光的相对强度，可间接反映脂质过氧化的水平。此法灵敏度高，且可以反映丙二醛与体内蛋白质的相互作用，具有重要的生物学意义。这一检测方法的机理很复杂，但灵敏度高，通常需要与标准荧光物质进行比较，以相对荧光强度作为脂质过氧化程度的表示。2.3.3硫代巴比妥酸法（TBA）TBA试验自1944年由Kohn和Liversedge提出即应用于食品和生物材料中脂类氧化的检测和定量，其应用程度居所有测试方法之首[7]。硫代巴比妥酸法是基于不饱和脂肪酸通过自由基反应，形成氧化自由基而氧化生成环氧化合物，环氧化