腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介1第二章应用重组腺病毒的优点2第三章AdEasyTM技术33.1技术概况33.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程44.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1克隆的一般原则44.1.2构建重组AdEasyTM转移载体54.2细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1共转化的一般原则54.2.2共转化方法54.2.3预期结果54.3AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增64.4AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞64.4.1细胞铺板64.4.2磷酸钙转化技术7第五章常用技术85.1QBI-293A细胞培养85.1.1QBI-293A细胞的初始培养85.1.2QBI-293A细胞的维持培养和增殖85.1.3QBI-293A细胞的冻存85.2QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生95.2.1感染QBI-293A细胞95.2.2病毒空斑形成95.2.3琼脂糖覆盖被感染细胞95.3MOI测定105.4腺病毒感染力测定105.4.1X-Gal染色115.5重组腺病毒的筛选和纯化115.5.1挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送115.5.2病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3Western杂交135.5.4Southern杂交和点杂交135.5.5病毒裂解产物PCR145.5.6免疫测定145.5.7功能测定145.6病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增155.7两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒165.7.1不连续密度梯度离心175.7.2连续密度梯度离心175.7.3病毒溶液去盐和浓集175.8病毒滴度测定185.8.1O.D.260nm(VP/ml)195.8.2空斑测定法205.8.350%组织培养感染剂量法20第六章疑难解答226.1QBI-293A细胞培养226.2感染力测定226.3转移载体克隆236.4在BJ5183细胞中共转化和重组246.5转染QBI-293A细胞256.6筛选和测定256.7在QBI-293A细胞中表达266.8重组腺病毒的扩增266.9纯化266.10病毒滴度测定27缩写英文全称中文全称AdAdenovirus腺病毒Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体AmpAmpicillin氨苄青霉素β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶bpBasePair碱基对BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNAcccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNACPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清HrHour小时ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素kbKilobases千碱基对KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点MinMinute分钟MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNAMWCOMOIecularWeightCut-offPAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白TETris/EDTATE溶液wtWildType野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hittetal，1999和Wiveletal，1999。腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massieetal，1998A,B）。但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（Heetal，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分购买后即可使用。第二章应用重组腺病毒的优点1.宿主范围广,对人致病性低这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。2.在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。3.能有效进行增殖，滴度高这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。4.无需辅助病毒，可容纳7.5kb外源DNA：为提供克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。此外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105%）。这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。5.与人类基因同源该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。6.不整合到染色体中，无插入致突变性逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。7.能在悬浮培养液中扩增：293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表达重组蛋白。8.能同时表达多个基因这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。第三章AdEasyTM技术3.1技术概览AdEasyTM系统是由T.C.He等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：1）腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2）基因组过大（36kb），难于操作。在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PmeI线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR，IavertedTerminedRepeats），转染QBI-293A细胞后产生重组病毒颗粒。同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5α等进行扩增。由于缺乏recA活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重组。3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需1-3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5α中扩增后转入哺乳动物细胞293A，最后将293A细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供E1区功能的293A细胞中进行增殖。一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需1小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。我们强烈建议初学者用QBI-Infect＋阳性对照进行感染力测定（见5.2.2）。进行这些测定之前，必须先扩增QBI-293A细胞（见5.5.1）。感染力测定使你能观察到病毒