组织工程讲座

心血管疾病组织工程学中南大学湘雅二医院胸心外科湖南省心血管疾病研究所吴忠仕讲义提纲•组织工程学基本概况•组织工程血管研究•组织工程瓣膜研究•心肌细胞移植研究•生物反应器组织工程学研究涉及到材料学、工程学、生物化学、分子生物学、细胞生物学、临床医学、伦理学等多学科交叉与结合组织工程组织工程概况器官移植制造组织器官生物工程基因工程组织工程Tissueengineeringistheapplicationoftheprinciplesandmethodsofengineeringandthelifesciencetowardthefundamentalunderstandingofstructure-functionrelationshipsinnormalandpathologicalmammaliantissueandthedevelopmentofbiologicalsubstitutestorestore,maintainorimprovefunctions.SkalakandFox(eds.),TissueEngineering,AlanLiss,1988Tissueengineeringisaninterdisciplinaryfieldthatappliestheprinciplesofengineeringandthelifesciencestowardthedevelopmentofbiologicalsubstitutesthatrestore,maintainorimprovetissuefunction.LangerandVacanti,Science260,1993组织工程定义TheAgeof'TissueEngineering'isuponus.Aswearethrusttowardanewmillenniumsotooareourbeliefsthattheamalgamationofengineeringandmedicinewillresultinanexplosionofknowledgethatwillenhanceourunderstandingofdevelopmentalbiologyandculminateinanewerainmedicineenablingustorestorelosttissuefunction.MikosandVacanti,TissueEngineering1,1995Thegoaloftissueengineeringistorestorefunctionthroughthedeliveryoflivingelementswhichbecomeintegratedintothepatient.VacantiandLanger,Lancet354,1999TissueEngineeringisalsooftenreferredtoasregenerativemedicineand/orreparativemedicine.组织工程的定义组织工程的基本要素组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织国外组织工程学研究Tepha公司和波士顿儿童医院获得美国商务部200万美元AdvancedTechnologyProgram研究基金，用于人工心血管组织的研制美国研制出人工心脏英国：利用骨髓干细胞修复受损心肌在美国，目前已经形成价值60亿美元的组织工程产业，并以每年25%的速度递增•培育的骨骼、软骨、血管、皮肤以及神经组织正在进行体内实验•再造的肝脏、胰脏、乳房、心脏、手指、角膜等正在实验室里生长成形据估计全球组织工程及其技术衍生产品则约有1000亿美元的潜在市场可供开拓国外组织工程学研究国内组织工程研究•1994年中国组织工程在上海起步（曹谊林）•1998年，国家“973”重点计划将“组织工程的基本科学问题”研究课题立项•中国修复重建外科杂志1997年开辟专栏介绍组织工程•中国组织工程和再生医学网•中国组织工程•1999年在中国修复重建外科学会下建立了组织工程学组•2004年曹谊林教授采用人体自身骨髓基质干细胞培养出了组织工程化的人体骨骼，最近已应用于临床国内组织工程研究我国开展组织工程研究的领先单位军事医学科学院基础医学研究所中科院化学所高分子物理与化学国家重点实验室中国医学科学院组织工程研究中心上海组织工程研究中心（“973”组织工程项目首席科学家曹谊林教授领衔）上海第二医科大学附属第九人民医院整复外科四川大学华西医院卫生部移植工程与移植免疫重点实验室组织工程研究室重庆大学生物工程学院生物力学及组织工程教育部重点实验室暨南大学生物医学工程研究所复旦大学高分子科学系聚合物分子工程教育部重点实验室1，胚胎干细胞的培养、诱导分化及鉴定上海等地建立了人类胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞系，建立了诱导分化为成神经干细胞、成肌肉干细胞、成血管内皮干细胞等技术，为应用胚胎干细胞作为组织工程种子细胞的来源进行了开创性的工作2，骨髓间质干细胞的分离、纯化及定向分化诱导北京和上海建立了成年骨髓基质干细胞作为组织工程种子细胞来源的成熟技术体系3，种子细胞功能老化规律和延缓老化的研究4，生物材料表面修饰及材料与细胞间亲和性改进的研究5，生物降解高分子合成、降解速率调控及支架构筑研究6，组织工程中的生物力学问题7，组织工程化组织构建研究上海成功构建组织工程化骨、软骨、肌健、皮肤、角膜基质、血管组织中国的组织工程学研究进展组织工程血管组织工程瓣膜组织工程心肌重建•先天性心脏病•冠状动脉疾病•血管疾病•瓣膜疾病•心肌疾病心血管疾病组织工程学研究范围心脏瓣膜替代物生物瓣膜机械瓣膜血管替代物Dacron人工血管膨体聚四氟乙烯（ePTFE）自体血管异体血管乳内血管大隐静脉异种血管同种血管理想的血管移植物生物血管人工合成血管免疫，血栓，感染，钙化组织工程化血管研究动脉静脉腔大，壁薄，管壁常塌陷中膜平滑肌和弹性组织不发达内弹性膜不明显或缺如部分静脉有静脉瓣内膜：单层扁平内皮细胞中层：SMC和胶原正常血管结构血管细胞外基质成分胶原非胶原糖蛋白氨基聚糖蛋白聚糖弹性蛋白血管胶原Ⅰ，Ⅲ型胶原为主纤粘连蛋白（FIBRONECTIN）细胞与基质连接基质与基质连接在肽链中央的与细胞相结合的模块中存在RGD序列，是细胞表面某些整合素受体识别与结合的部位氨基聚糖与蛋白聚糖在心血管基质中主要为硫酸软骨素硫酸皮肤素硫酸乙酰肝素弹性蛋白（elastin)组织工程化血管血管组织工程学的目的在体外构建理想的血管移植物•具有高度的组织相容性•可生长性•可塑性•无排异反应•无血栓形成•不易感染•无免疫排异反应•能维持管腔的长期通畅内皮化人工血管•1986年Jarrell将获取的ECs接种于Dacron•1999年Deusch等将血管ECs种植于ePTFE上•ECs在材料上长期黏附和存活问题需进一步改进以胶原为基础的组织工程血管研究•1986年Weinberg从动物体内分离得到的胶原制成管状网格支架•在支架外套上Dacron网,再接种成纤维细胞•向管内注入ECs悬液行旋转培养•建成了类似的肌性动脉•1998年L′Heureux分别用血管SMCs和人皮肤FBs进行培养•细胞和ECM融合成膜片状物•将FBs膜片套在ePTFE多孔管轴外,裹上SMCs膜片;再裹上FBs膜片•待管壁细胞和ECM成熟后,脱去ePTFE管轴•最后在腔内接种ECs,培育出有生理活性的天然环层结构血管以细胞膜片技术为基础的血管移植物该TEBV的优点为:•有生理活性,可自我更新•植入后的血管可自行适应体内环境•感染率低,机体免疫反应小,远期通畅率高•制作设备简单其缺点为:•制作周期长,需要3个月以上,临床应用不便•缺乏足够的动物实验及临床观察的依据来判断其在体内的生物学行为•管壁力学强度有待进一步提高组织工程应用的可降解材料聚乳酸(polylacticacid，PLA)聚羟基乙酸(polygly-colicacid，PGA)两者的共聚物(PLA/PGA)聚4－羟基丁酸盐（P4HB）聚乙醇酸(PLLA)可吸收材料为支架的TEBV1998年,Shinoka以聚乙二醇酸(PGA)制成管状支架将羊血管细胞种植于支架上,置换相应长度的幼羊主肺动脉的11周后,支架结构完全消失,管壁内胶原蛋白含量相当于自体肺动脉的73%是一种具有生长、修复功能的活血管该TEBV存在以下缺点:•PGA的机械支撑力较弱,用于肺循环尚可,却难以耐受较高的体循环压力•PGA过于僵硬,手术缝合性不佳可吸收材料为支架的TEBV•1999年,Shum-Tim用羟化烷烃的聚合物(PHA)的双层管状支架构建了TEBV。内层以有孔的PGA网作为细胞载体,外层以无孔的PHA加强机械支撑作用,该TEBV的血管壁中胶原蛋白到3个月时占相应自体腹主动脉的25%,5个月时达99%,内层有平整的内皮细胞,中层有大量的弹力纤维生成•2001年,Hoerstrup采用了一种新型可吸收的PGA/P4HB复合材料•通过热焊接技术,制成管形支架•采用动态培养.•该TEBV达到了一定的抗张裂强度和缝合固持度,基本符合外科手术的要求可吸收材料为支架的TEBV2003年,东京女子医科大学的Matsumura将骨髓干细胞(BMCs)作为细胞来源制成了TEBV,进行了22例临床实验,没有发生管道的血栓形成和狭窄以及因该项技术而导致的患者死亡组织工程血管作为心外管道行全腔静脉肺动脉连接组织工程血管临床应用天然生物性材料来源于生物体可分为大分子无结构材料如胶原胶、藻酸盐等去细胞纤维组织材料脱细胞小肠粘膜下层基质脱细胞真皮基质脱细胞血管基质•生物材料提供近似体内组织发生发育的ECM支架条件•植入体内时无或只有极低的免疫排斥反应。•血管相容性,顺应性、通畅率等都优于非天然生物性材料血管天然生物性材料为支架的TEBV组织工程血管的发展方向血管组织工程学仍然处于实验探索阶段目前TEBV面临着巨大的挑战:•机械强度和弹性:可以承受一定的肺循环压力,体循环压力难以承受•远期通畅率:小口径(6mm)TEBV的远期通畅率仍不理想•TEBV的顺应性如何能更好的与临近受者血管相匹配组织工程血管的发展方向种子细胞来源•目前主要选用各种成熟的功能细胞再分化能力低培养生长慢难以保障功能的完整性胚胎干细胞或骨髓基质干细胞作为种子细胞是今后重要的发展方向组织工程血管支架/细胞外基质异种或同种血管组织（如去细胞的猪主动脉，BJVC）是常用的天然生物组织冻存的同种血管已用作冠脉搭桥管道，其缺点是通畅率差和容易形成动脉瘤天然生物组织人工高分子可吸收材料PGA/P4HB复合材料组织工程血管的发展方向•细胞与细胞间信号传导•细胞与ECM相互作用•细胞生长同生长因子间的关系•种子细胞的黏附、迁移、分化、生长研究•生物反应器仿生条件的选择组织工程学三维培养技术的研究组织工程血管的发展方向组织工程心脏瓣膜需要终身抗凝由于抗凝导致的出血,血栓和感染不能随人体的生长而生长或塑形较好的血流动力学特点抗感染能力相对较强无需抗凝潜在的免疫原性或鞣制剂抑制宿主自体细胞的生长，导致了生物瓣耐久性差机械瓣生物瓣人工瓣膜特点组织工程瓣膜的构建理想的瓣膜支架/基质材料须具备特征良好的生物相容性良好的生物降解性具有三维多孔立体结构良好的可塑性和一定的机械强度良好的细胞-材料界面基质材料生物可降解高分子材料生物可降解高分子材料所制成的瓣膜支架可随着种植细胞外基质的形成,支架逐渐降解、重吸收,被新生瓣膜组织细胞取代,最终在瓣膜组织中不遗留任何异物,因此,它无疑是瓣膜支架的最好选择聚乳酸(polylacticacid，PLA)聚羟基乙酸(polygly-colicacid，PGA)两者的共聚物(PLA/PGA)聚4－羟基丁酸盐（P4HB）聚乙醇酸(PLLA)消除了抗原性和免疫原性保持正常瓣膜三维