细胞工程-第3章-mdf

Chapter3细胞培养的基本方法◆3.1无菌操作技术◆无菌操作防止污染是细胞培养成功或失败的首要条件一、无菌操作技术要领–总体要求：•动作准确敏捷•不用手触及已消毒物品•操作面布局合理•操作保持一定顺序•培养用瓶和吸管的放置•防止各种用液的交叉污染•不向操作员讲话或咳嗽3.1.1材料与设备器材的准备与消毒•按照实验要求，准备实验材料并进行消毒待用；实验设备预先调试，实验器材预先消毒。•准备卡片记录需用器材和物品名称、要求及数量等，实验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作场地，然后进行消毒，可避免操作开始后，因物品不全而往返拿取时增加污染机会。3.1.2超净台和培养室的消毒•超净台实验前用70%酒精消毒，配合紫外线灭菌灯(每次开启15min以上)等消毒灭菌。注意：在用紫外线灯照射期间，在操作台面上勿放置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖)。•无菌室应定期用70%酒精或0.5%苯酚喷雾降尘和消毒，用2%新洁尔灭抹拭台面和用具(70%酒精也可)，用福尔马林(40%甲醛)加少量高锰酸钾定期密闭熏蒸，配合紫外线灭菌灯(每次开启15分钟以上)等消毒灭菌手段，以使无菌室经常保持高度的无菌状态。3.1.3洗手与着装•无菌的实验服，帽子和口罩，有时还要准备无菌手套。服装平时用紫外线照射消毒。•进行培养工作时，如利用净化台，仅戴口罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。•实验操作前，出入无菌室，接触污染物等情况下要以75%酒精（或0.1%新洁尔灭）洗手和前臂。3.1.4无菌操作•1、在无菌环境进行无菌操作时首先要点燃酒精灯,以后操作如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经过火焰烧灼进行。•已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼，因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入培养液中。•注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。•金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。无菌操作（续）•2、进行培养操作时，动作要准确敏捷，但不必太快，以防空气流动，增加污染机会。•不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒触及部，如不便消毒时，应取备品更换。•升汞为剧毒药品，一则使用时注意别溅到皮肤上，二则使用后要进行处理，不能直接倒入下水道。升汞处理方法：升汞＋Na2S－－－絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）－－＋FeSO4（中和过多的Na2S）。无菌操作（续）•为便于拿送用品，工作台面上的用品要有合理的布局.原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。超净台内物品的摆放布置：不要过多过杂；按照左右手的习惯依次摆放。无菌操作（续）•工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。•培养液在未用前，不要过早开瓶；用后如不再重复使用，应立即封口。培养用瓶开瓶以后，应保持45度斜位或平放，开口向上长时间直立可增加落菌机会。无菌操作（续）•吸取各种用液时均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。•工作中不能面向操作台讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。无菌操作（续）•3、实验结束后，将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个实验，则用70%酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10min后，才可进行下一个实验操作。无菌操作（续）•4、净工作台的操作规程。•4.1超净工作区内严禁存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不变。•4.2每月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标准，应调节调压器，改变风机输入电压，使工作台处于最佳状况。•4.3上班前，清洁工人必须对工作台周围环境进行清洁工作，对空气进行净化处理。•4.4操作人员进入超净工作区前，必须在缓冲间穿衣、裤，戴帽子、手套等，并尽量避免作明显扰乱气流流型的动作。•4.5使用工作台时，应提前50min打开紫外线灭菌灯处理净化工作区工作台表面积累的微生物，30min后关闭灭菌灯，启动送风机。•4.6工作完毕后，0.1%新洁尔灭擦拭净化工作台面，关闭送风机，打开紫外灯灭菌30min，最后关闭电源。接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中。正确错误整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速。正确错误防止操作带来的污染，接种过程中尽可能达到悬空要求。正确错误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正确错误瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正确错误接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生Chapter3细胞培养的基本方法◆3.2培养细胞的观察细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。3.2.1培养细胞的观察方法1.肉眼观察•肉眼观察培养液的颜色和透明度的变化。•正常情况下，培养液pH介于7.2～7.4之间，呈桃红色清亮透明。（指示剂：酚红）•培养时，细胞代谢会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。•发现培养液变黄，应及时换液传代。一般生长稳定的细胞2～3天换液一次，生长缓慢的细胞3～4天换液一次。苯酚红Phenolred别名：酚红；苯酚磺酞；Phend-sulphonphthalein分子式：C19H1405S相对分子质量：354．38性状:红色结晶性粉末。微溶于水，易溶于乙醇及碱溶液，不溶于三氯甲烷及醚。溶于稀碱溶液呈红色。用途：酸碱指示剂，pH值1.2（橙）～3.0(黄），6.5（棕黄）～8.0(紫红）酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。•生长良好的细胞，细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。•相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。•若细胞生长状态不良可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。2.显微镜观察培养的CHO细胞3.2.2培养细胞的检测指标1.细胞计数细胞生长状况有关指标的检测方法Cellcountingusingahaemocytometer细胞计数方法•原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。•具体操作：•1.将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。•2.将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。•3.计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。细胞计数方法（续）然后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104•说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3；而1ml=1000mm3（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液）细胞数/毫升细胞悬液＝4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数1毫米计数原则：不数死细胞（染蓝）、压线细胞数上不数下，数左不数右，一团细胞按一个计数！视频：细胞计数.wmv1毫升＝1立方厘米2.细胞生长曲线如何作？page73培养细胞的检测指标◆生长曲线是培养细胞生物学特性的基本参数之一，是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标。◆常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响！3.细胞分裂指数•细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标。它以被测1000个细胞中的分裂细胞数来计算。其方法为：用秋水仙素将细胞处理1～2小时后，按染色体制片法制片并染色，计算1000个细胞中分裂相的数目，重复4次取平均值，用百分比表示。培养细胞的检测指标基本步骤：(1)细胞准备用盖片(支持物)培养法。(2)每24小时取出一个小玻片，按常规方法进行固定，吉姆萨或HE染色，封片，制成永久标本。(3)显微镜下选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞并计数。逐个视野进行，对每一时间组的玻片各取细胞多、中、少3个区域各一区，共数1000个细胞，计算出平均分裂相值所占百分比。观察时要掌握好分裂相标准，主要是确定好划分间期和前期，末期和间期等的界限，以减少误差。细胞分裂指数=细胞分裂相数/细胞总数(1000)×10004.细胞贴壁率细胞贴壁率又称细胞接种存活率。它是细胞被制成分散的悬液后，以低密度(2～5个细胞/cm2)被接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群(克隆)的细胞百分数值，用以表示细胞的生存能力和细胞群的活力。培养细胞的检测指标（1）取对生长期细胞，用消化法制成细胞悬液，计数后按检测细胞生长曲线的接种细胞的原则，将细胞接种于培养瓶(浓度相对高些)。接种12～15瓶。（2）每2小时取出一瓶细胞，倒掉培养液，然后加入胰酶消化已贴壁细胞，计数已贴壁细胞，用下面公式逐个计算每个时间上的贴壁率。每2小时一次，共观察24小时即12。接种存活率%(贴壁率)=(贴壁存活细胞数/接种细胞数)×100%基本步骤：5.细胞周期•(1)同位素标记有丝分裂百分率法（percentagelabeledmitoses，PLM）：•对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。放射标记物为3H或者14C标记的TdR(胸腺嘧啶核苷)。培养细胞的检测指标50100TG20TMTsTcTG2+1/2TM常以TC-（TG2+TM+TS）的方式求出TG1(2)流式细胞仪检测细胞周期•通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度，来快速分析颗粒的物理或化学性质，并可以对细胞进行分类收集，可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。流式细胞仪6.MTT法测定细胞活力四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)四唑盐比色法的原理：活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臜（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。培养细胞的检测指标操作步骤：（1）细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。每隔24小时测量一个点，3个平行样品！7.克隆形成率•细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。培养细胞的检测指标(1)平板克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的R