细胞工程之种质保存技术

植物种质：植物亲代通过生殖细胞或体细胞传递给后代的遗传物质植物种质资源：携带各种不同遗传物质的植物总称种质资源是育种、开发利用以及科学研究的重要物质基础，故世界各国均非常重视植物种质资源的考察、收集、保存据美国《时代》杂志网站报道，距北极点约1000公里的挪威斯瓦尔巴群岛的一处山洞中有一座“世界末日种子库”假设有一天地球上发生毁灭性的灾难，那时幸存的人类就可以取出种子库中存放的种子植物诺亚方舟据介绍，挪威政府兴建的全球种子库有两个特点◦一是建在冻土地带的岩石中，几乎不受气候变化的影响（-18℃），且能抵御原子弹爆炸和强烈地震◦二是位置高于海平面１３０米左右，即便格陵兰的冰盖和南极洲的冰层完全融化，也不会被淹没由6万根蕴含植物种子的透明亚克力杆组成所有的种子都来自‘千年种子银行项目’植物为人类提供了氧气、食物、药品和建材，然而到本世纪末，它们中的2/3却面临永远地灭绝的危险。如果气温升高两度，那么15%到40%的植物将灭绝。种子银行的主要功能是进行物种储存，一旦某个植物物种灭绝，种子银行就可随时起用其种子，让这个物种得以恢复。在适宜的环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术一般有2种方式◦就地保存：通过建立自然保护区、森林公园等来实现种质保存的目的◦迁地保存：通过建立植物园、种质资源圃、种子库、离体保存等方法来实现世界第一个保护区、1872年、美国西安周至金丝猴保护区白河川金丝猴保护区沿渡河金丝猴保护区红拉山滇金丝猴保护区巴东县沿渡河金丝猴自然保护区芒康滇金丝猴国家级自然保护区西安金丝猴自然保护区1.卧龙大熊猫自然保护区2.王朗大熊猫自然保护区3.佛坪大熊猫自然保护区4.勿角大熊猫自然保护区5.甘肃陇南文县白水江大熊猫自然保护区6.文县尖山大熊猫自然保护区7.武都裕河大熊猫自然保护区8.迭部多儿大熊猫自然保护区9.阿夏大熊猫自然保护区10.彭州白水河国家级大熊猫自然保护区11.崇州鞍子河大熊猫自然保护区12.都江堰龙溪虹口国家级大熊猫自然保护区彩林植物现有的自然保护区中，国家级自然保护区243个，占保护区总数的10.34%，地方级保护区中省级自然保护区773个，地市级保护区421个，县级自然保护区912个无论是就地保存还是建立植物园和苗圃，均会耗费大量的土地以及人力物力还有可能受病虫害及其他自然灾害的影响使植物种质遭受损失在一定范围内，种子的湿度每降低1%，保存时间翻番；同样，保存温度每降低5℃，种子生命活性保持也能倍增基于这样的研究，种子库的湿度一直低于10%，而温度则维持在零下20℃。一般情况下，种子库的植物种子在湿度小于10%和零下20℃的条件下至少能保持10年内仍充满活性。每过10年，科研人员就会对种子进行发芽抽样测试，以确保它们仍具有生命力，如果效果不好，就立即更换一批。理论上讲，种子的最长保存期可以达到200年。英国皇家植物园的生物学家在2006年成功地在实验室条件下将200多年前、英王乔治三世时期（1803年）保留下来的一些槐树种子培育发芽，创造了搁放时间最久还能生长发育的植物种子的纪录。1.对于寿命短的种子，每隔几年就得繁殖一次，成本较高2.某些种子干燥时会失去活力或受到损伤3.对于长寿树种，可能会有很多年不结种子4.很多植物通过无性繁殖繁衍后代，没有种子对于上述植物可通过离体保存技术来长期保存离体培养的植物细胞、组织、器官和试管苗等保存于人工环境下，一般是在低温或超低温条件下，抑制其生长，达到长期保存的目的节约大量土地、人力物力，节省费用种质不受病虫害侵染，便于种质交流保存的种质一旦需要，可迅速通过组织培养技术进行快速繁殖，有利于种质的利用和推广1.超低温冷冻保存技术2.低温保存技术3.常温保存技术基本原理：将植物材料加入一定的冷冻防护剂，再经一定的方法处理后，贮存在-80℃（干冰温度）至-196℃（液氮温度）的超低温条件下所用的植物材料◦离体培养的原生质体、细胞、组织、器官、小植株◦植物的花粉、蕨类植物或海藻的孢子等-196℃的超低温条件下，细胞内的物质代谢及生命活动处于几乎完全停止的状态，遗传变异也降到最低。理论上植物材料放在液氮中可以无限期贮存。植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的60～90％。细胞中的水是由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90％，很容易冻结。种质超低温保存成功的关键，在于降温冰冻过程中避免细胞内结冰超低温保存有三个重要操作步骤：1.预冻2.在-196ºC下长期贮存3.解冻1.细胞质浓厚的分生细胞2.处于旺盛的对数分裂期的细胞常选择细胞培养物、植物茎尖、幼胚、幼苗等作为冷冻保存的材料注意事项◦1培养代数过多，可能会使细胞失去再生能力◦2培养时间过长会使细胞液泡化◦3长期培养的愈伤组织和细胞在遗传上容易变异选择培养代数低的材料结构紧密的细胞团与愈伤组织要比单个细胞及松散的细胞团更耐受冷冻野外生长的材料◦选择经过冬天低温锻炼过的植株来自于抗寒植物的材料，其抗冻性较一般植株强在冷冻之前对细胞进行预处理，可改善细胞的抗寒能力，从而提高细胞冷冻处理后的存活率常用方法◦低温◦培养基加入渗透剂、DMSO◦脱水处理通常将材料放在0℃左右处理数天至数周对于低温敏感的植物材料尤为重要康乃馨无性系在4℃培养3天后进行超低温保存，解冻后茎尖存活率较未进行预处理的材料明显提高渗透剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖、脯氨酸等脯氨酸是植物体内天然的防护剂使细胞的体积降低，提高材料的抗冻性，增加冷冻后的存活率将细胞脱水到适当程度，可大大提高材料冷冻及解冻后的存活率而且含水量低的材料，对解冻速度的要求更为宽松1.降低冰点，促进过冷却和玻璃态化的形成；2.提高溶液的黏滞性，阻止冰晶形成；3.DMSO可以使膜物质分子重新分布，增加细胞膜的透性，在温度降低时，加速细胞内的水流往细胞外结冰；4.稳定细胞内的大分子正常结构，特别是膜结构，阻止低温对膜的伤害。甘油、糖、糖醇类、DMSO、脯氨酸DMSO二甲基亚砜：预培养24-48h，或用二甲基亚砜进行预冷处理，一般时间为20-60min，可大大提高存活率但是应注意其细胞毒性，使用浓度不宜超过5%渗透性冷冻防护剂多属于低分子量的中性物质，容易与水分子结合，发生水合作用，从而增加溶液的黏度，降低溶液冰点，减弱水的结晶过程，即冰点中心增长速度下降，削弱了水的固化程度故在冷冻与解冻过程中，培养基与细胞内的冰点降低，从而保护了植物材料乙二醇的含量为68％时，冰点可降低至-68℃由于冷冻防护剂的加入，培养基的渗透压提高，使细胞产生轻微的质壁分离，增加了细胞的耐寒能力二甲基亚砜等极易渗入细胞内部，从而防止在冷冻及融化过程中细胞过度脱水而受到破坏非渗透性冷冻防护剂在特定温度下可降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护材料的作用大部分冷冻防护剂具细胞毒性，处理温度愈高，毒性愈大，故需在0℃下进行处理时间不宜过长，一般不超过1h根据不同的植物材料，选择不同的冷冻防护剂若单独使用效果不大，往往组合使用可获得较好的效果冷冻时，细胞内外主要发生理化变化◦细胞外的溶液水分子先形成冰晶中心◦冰晶中心的形成速度与溶液成分和降温速度有关◦一般在-20～-60℃范围内，冰晶中心增长最快，形成大块冰晶后速度减慢，到-140℃时完全停止增长冷冻方法◦慢速冷冻法、快速冷冻法、逐步冷冻法、预冷冻法、干冻法、包埋脱水法、玻璃化法、利用驯化冰箱法将加入冷冻防护剂的材料，以0.1～10℃/min的速度逐渐降低其温度，待降至-40℃或-100℃时，浸入液氮中贮存慢速冷冻过程中细胞内的水分外渗并转化为冰晶，既对冷冻细胞有脱水作用，又防止了细胞内冰晶的形成，避免了冰冻伤害适用于液泡化的成熟细胞经冷冻防护剂处理的样品直接转入-196℃液氮罐或液氮库，冷却速度达到1000℃/min快速冷冻时，由于迅速通过细胞冰晶生长的临界温度区域，避免了细胞内形成致死的大冰晶适用于细胞体积小、胞质浓、含水量低的材料（茎尖、生长点或花粉）又称逐步冷冻法先逐渐冷却（1℃/min）或分步冷却（约5℃/min）至-30～50℃，停留约30min，使材料脱水，然后投入液氮迅速冷却对于茎尖和芽的冷冻保存最有效，对悬浮细胞也有一定效果经脱水处理后投入液氮中冷冻脱水（干燥）预处理能增强材料的抗冻性适用含水量较高的薄壁细胞常用的脱水方法◦真空干燥法、烘箱、硅胶干燥、在含高浓度渗透性化合物（甘油、糖类等）的培养基上培养效果最好培养材料由褐藻酸盐包埋成球状颗粒，在含高浓度的蔗糖溶液（0.75mol/L）中预培养一段时间经无菌空气或硅胶部分脱水后进行慢速或快速冷冻用高浓度的蔗糖预处理材料，可避免DMSO和甘油的化学毒性，目的在于提高胞质浓度，增加抗冻力和抗脱水力适合对低温保护剂敏感的植物培养材料包埋后，避免了其裸露时可能受到的损伤，使材料所处的环境更为恒定优点◦1易于操作◦2避免使用DMSO◦3免去了程序降温仪的使用，降温过程比较随意◦4可用较大的培养材料玻璃化是将某种物质转变成玻璃样无定形体（玻璃态）的过程，是一种介于液态与固态之间的状态，在此形态中没有任何的晶体结构存在玻璃化是冷冻生物学中一项简单、快速而有效的保存有生命的细胞、组织和器官的方法通过玻璃化法降温保存细胞时，细胞内外的水都不形成结晶，细胞结构不会受到破坏从而细胞得以存活任何液体只要有足够的降温速度都可以进入玻璃态纯水玻璃化：需要的降温速度是1010℃/min两种方法可显著降低形成玻璃化所需的降温速度◦1.使用高浓度的保护剂，即玻璃化溶液（VS)◦2.增加静水压力◦随着保护剂浓度提高或静水压力提高，均一晶核形成温度下降，玻璃化形成温度上升贮存期间关键要把冷冻温度持续维持在-196℃条件下，不发生温度的上下波动一般认为：在-196℃液氮温度下，冰晶不会增长及重新形成冰晶在以大豆茎尖为材料做超低温冷冻实验时发现：贮存在-86℃时，随着时间的延长材料的活力逐渐丧失，而在-196℃时材料活力几乎不损失快速解冻法◦将材料直接放入35-40℃的水浴中解冻，一般约需1～2min的时间◦可防止组织和细胞脱水死亡，也使冷冻材料快速通过使细胞和组织形成冰晶及冰晶增长的危险温度区域，从而避免冰晶对细胞和组织的伤害◦一旦冰完全融化，应迅速移开材料，防止热伤害及高温下保护剂的毒害慢速解冻法◦在0℃、2～3℃或室温下进行解冻，这种方法易使细胞内重新形成冰晶，故应用较少◦若冷冻前把细胞的含水量降到一个适当的水平，则可减低慢速解冻的不利影响，所以该方法多用于脱水处理材料的解冻由于冷冻保护剂对植物细胞有毒害作用，故在培养冷冻材料前，需对冷冻保护剂进行数次洗脱，一般用液体培养液进行清洗对于冷冻前进行脱水处理的材料，为了避免质壁分离的细胞复原时产生伤害，一般对冷冻防护剂逐渐进行稀释冷冻后复原的材料进行重新培养时，培养条件有可能和冷冻前有一定的变化如：经超低温冷冻的番茄幼苗茎尖必须在培养基中加入GA3才能使材料直接发育成小苗，否则形成愈伤组织较常用，适于保存中短期种质定义：将种质用离体培养的方式贮存在非冻结程度的低温下（1-9℃），但热带亚热带植物在10-20℃之间也能延缓生长，也称中低温调控生长保存在1-9℃温度下，植物材料的生长速度减缓，但不会完全停止，因此仍须对材料进行继代，只是间隔时间可以延长至几个月到几年低温保存种质不仅方法简单，而且存活率也很高一旦需要利用这些材料，只需在常温下继代培养便可迅速恢复生长到目前为止，该方法已在众多的果树和草本植物中得到应用，如葡萄、草莓、柑橘、苹果、马铃薯等1969年，Galzy最早利用葡萄分生组织培养的小植株，在9℃条件下进行保存，每年继代一次，保存长达15年之久用此法保存800个葡萄品种资源，每个样品重复6个，用地面积仅占2m2；但若在田间保存同样数量的种质，则需占地1万m2在4℃条件下保存无病毒的草莓植株，每3个月加几滴新鲜的培养液，可保存6年之