色谱技术答案

1若想建立某中药的醇提液的RPHPLC指纹图谱，是采用等度洗脱还是梯度洗脱？简述其分析条件的优化。答：1系统梯度洗脱由于中药的醇体液成分复杂，样品的K（容量因子）范围宽，不能用等度洗脱，梯度洗脱可以使不同K值的样品成分洗脱时随流动相的连续改变而趋于同一K值，谱峰尖锐而对称，分离度改善，缩短分离时间，降低最小检测量和提高分离精度，从而让所有成分均出峰2．优化思路：梯度期间，强溶剂的浓度B%增大，优化梯度条件起始B%，终止B%，梯度时间t和溶剂B的种类，因此在RPHPLC指纹图谱建立时，考虑流动相种类，流动梯度范围和梯度斜率三方面。（1）流动相种类的选择：RPHPLC中常用甲醇，乙腈，四氢呋喃等有机溶剂与水混合，流动相种类由样品分离难易程度决定。MeoH、CAN、THF洗脱强度逐渐增高，样品易分离时采用溶剂优化法选择流动相和水的最佳比例，调整K值，使其在1—20(tR:3—35min).（2）梯度范围：即起始和终止B%一般为5%--100%（tR：30min）若谱图前段空白可提高初始B%，末端空白需降低终止浓度，可节省时间缩小梯度范围使所有组分短时间从柱中洗脱出来（3）梯度斜率：根据初步分离的谱图，峰密集部位可降低斜率，减小强溶剂B%变化速度，峰疏散部分提高梯度斜率，时间短2，根据Vandeemterf方程在液相色谱中的表现形式，分析在HPLC中影响柱效的因素及实验条件的选择。答：VanDeemter方程在液相色谱中表现形式为:(1)影响柱效的因素：a.涡流扩散项：为避免涡流扩散而引起的峰扩张，需用小而均匀颗粒填充颜色等等b.纵向扩散项：HPLC中Dm仅有Gc的10-4—10-5倍，该项系忽略。c.固定相传质阻力项：降低固定液膜厚度，加快组分在固定相中的扩散d.流动相传质阻力项：组分分子随流动相进入色谱柱时，靠近固定相颗粒的部分分子流速较慢，中央分子流速较快，而引起峰扩张，要降低该项需减小dp和u，增大Dm.e.流动相滞留传质项：固定相的多孔性使部分流动相滞留于固定相某一局部，流动相中组分分子必须自流动相扩散到滞留区，才能与固定相进行质量交换，为降低该项，应采用颗粒小，微孔浅，孔径大的固定相。（2）选择实验条件以提高柱效：减小填料孔穴深度，减小填料粒度；用低粒度溶剂做流动剂，流动相采用低流速；适当提高柱温。3、分析影响分离度的因素及提高分离度的措施答：分离度是衡量分离效果的指标，基本分离方程：分离度受动力学和热力学因素两方面的影响，因素有：效率因子n，选择性因子α，容量因子k’。1）n：当固定相确定后，要使分离达到某一分离度，柱必须有最低限度的理论搭班数，增加柱长，减小柱H均可提高分离度。2）α越大，柱选择性越好，α微变是R有较大变化，α∝1时，更为显著。Α的增加对提高分离度最有效，可通过改变固定相、流动相、柱温、样品结构一衍生化，使α变大提高分离度。3）k’：R正比于，在填充柱GC中，R较大，k’对R影响可忽略。在液相色谱中，由于固定相对于流动相体积而言很小，溶质在固定相种的量亦很小，当k’增大时，R也迅速增加，k’可通过控制溶剂极性大小来调节。2、提高分离度的措施：1）改变流动相的组成：增加α。2）改变流动相的PH：限用于样品为能电离的酸或碱。3）改变固定相：因需换色谱柱、流动相，使k’、α在合适范围内不方便。4）改变分离温度：升高温度，k’值减小，可减小溶剂洗脱能力来抵消此效应。5）采用各种配位反应：提高分离的选择性。4影响薄层展开的因素有那些类型？如何影响的？uDdfkkuDdpuCuBAHsms22132/22/１．相相对对湿湿度度展开时，最佳相对湿度范围决定于溶质和溶剂的极性，随溶质、溶剂极性的增加，相对湿度范围也增大。因为展开室中展开剂蒸气分子有取代吸附在薄层上的水分子的趋势，取代量决定于展开剂蒸气的极性和量；展开剂蒸气分子极性越大，越易取代吸附的水分子，使原吸附的水分下降，使薄层上吸附的水蒸气的影响越小。２２．．溶溶剂剂蒸蒸气气的的影影响响①展开室饱和有以下情况A．展开室饱和：展开剂蒸气在展开室中达到平衡B．预吸附：薄层板干燥板面对展开室气体分子的吸附C．吸附饱和：薄层板干燥板面与展开室饱和气体空间达到平衡D．毛细管饱和：薄层板所有的自由空隙借毛细管作用被溶剂充满的过程，即相当于展开后薄层的状态②“边缘效应”薄层边缘处低极性溶剂挥发快，因此边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，Rf值相应增大③“脱混”、“双前沿”未饱和展开时，吸附剂对多元展开剂的亲和力不同，∴展开剂的上升速度不同（亲和力ABC，则Rf值ABC）产生脱混；当展开剂极性差异较大时，由于吸附剂对不同极性溶剂产生不同的吸附作用，形成展开剂组分的浓度梯度，溶剂完全分离，产生“双前沿”现象。３．温温度度的的影影响响温度对纸色谱影响较大对TLC影响较小４．展展距距的的影影响响∴PC：20～30cm；TLC：10～20cm；HPTLC：5～10cm５５．．展展开开室室的的放放置置水平、稳定、避免阳光直射，不要通风，离开热源，光敏物质的分离要置于暗处5GC程序升温对于宽沸程的样品——程序升温(单阶程序升温、多阶程序升温)在分析过程中柱温随时间而变化，通常是升高柱温。它的优点是：减少分析时间，整个分离过程中峰形一致,检测和测定更容易。缺点：样品组分将经历比恒温分离更高的温度这可能会导致某些敏感组分降解，在两次进样之间柱温箱必须冷却到初始温度这样就抵消了部分所节省的分析时间。初始温度、初始时间、升温速率、终止温度、终止时间程程序序升升温温（1）升温方式单阶：沸点范围宽的同系物多阶：复杂样品（2）初温程序升温中初温的选择依据是：①样品组分的挥发性，一般初温选择低于样品中主要挥发组分的沸点温度；②固定相的粘度，初温应高于固定相的凝固温度。对于未知样品，一般初温可选用室温。③太低：t长太高：分离度↓（（33））终终温温在在程程序序升升温温分分析析时时终终温温主主要要依依据据下下述述两两点点来来进进行行选选择择：：①①样样品品的的稳稳定定性性，，②②高高沸沸点点组组分分的的保保留留温温度度和和固固定定液液的的最最高高使使用用温温度度。。（（44））升升温温速速率率升温速率快：分离度降低，分析时间缩短。填充柱：d3～5mm，L2～3m，r=3～10℃/min毛细管柱：0.25mm25～50mr=0.5～4℃/min6请简述影响HPCE峰面积重现性的因素及其解决办法1.纵向扩散的影响纵向扩散引起的峰展宽，σ2等于2Dt,由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获因素起因解决方法温度变化粘度和进样量的变化使用可调节温度的毛细管样品蒸发样品浓度提高用带盖的小瓶或冷却自动进样器仪器的局限性没有足够的数据采集率延长进样时间样品夹带物进样量大使用平整、光滑的进样毛细管；将毛细管末端的聚酰亚胺除掉；进样后在缓冲溶液中或水中浸毛细管浸在样品中的毛细管引起的零进样进样量大不能消除但可以量化样品吸附在毛细管壁上峰形扭曲；非洗脱样品改变缓冲液的PH值；增加缓冲液的浓度；使用涂层毛细管低信噪比积分错误优化积分参数；增加样品浓度；使用峰高高压的出现缓冲液的热膨胀和样品排出斜坡分离电压电动进样样品基质的变化使用流体力学进样得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样的影响当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：Winj=(24Dt)1/2。实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。3.焦耳热与温度梯度的影响电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：Lm—电解质溶液的摩尔电导；I—工作电流：cm—电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：①减小毛细管内径；②控制散热；4溶质与管壁间的相互作用存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；a采用细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。b加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。5.其他影响因素（1）电分散作用对谱带展宽的影响当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2）“层流”现象对谱带展宽的影响。一般情况下，HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；产生的原因：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。7UPLC和HPLC，较之于以往的HPLC，其性能优势体现在哪里，技术关键是什么？与传统的高效液相色谱（HPLC）相比，UPLC具有以下优势：1.高分离度（ultraresolution）根据液相色谱分离的解析度方程，解析度正比于柱效能的平方根而根据范迪姆特（VanDeemter）色谱理论，柱效反比于系统固定相粒度大小。UPLC系统运用的固定相粒度能达到1.7μm，根据上述方程，该系统达到的效能将比5μm粒度系统高70%，而比3.5μm高40%。2.高速度（ultraspeed）在保证得到同样质量数据的前提下，UPLC能提供单位时间内更多的信息量。在不影响解析度的的情况下，小粒度能提供更高的分析速度，同样也能使柱长减少，根据VanDeemter色谱理论，最优流速反比于粒度大小。例如，运用1.7μm的颗粒，相对于5μm颗粒，在不影响柱效的情况下，柱长将可以立方级的减少，而且可以在3倍的流速下运行，相同的解析度情况下，分离速度提高了9倍。3.灵敏度（sensitivity）过去对于提高灵敏度的研究大都集中于检测器上，不论是光学检测器还是质量检测器。但是，其实运用UPLC也能提高分析的灵敏度。UPLC能提高柱效N，从而使峰宽w变的更窄，而峰高却增加了，同时，由于UPLC运用了更短的柱子（柱长L更小），进一步增加了峰高。因此，在提高柱效的同时，运用1.7μm的UPLC系统比5μm和3.5μm的系统灵敏度分别提高了70%和40%，而在柱效下相同情况下，能分别提供3倍和2倍的灵敏度。技术关键：根据VanDeemter方程H=A+B/v+Cv①颗粒度越小，HETP越低，柱效越高，分离度越好②对于小颗粒，通过高流速获得高分离速度③对于小颗粒，提高流速时HETP不会提高－提高分离速度补充（其他答案可以不写）：优点：节约时间；节约溶剂；超高灵敏度；超高分离度缺点：高压力1、提高分离速度小颗粒填料的速度优势分离度RS∝L/dp，即保持L/dp，同比缩短柱长,以提高分离速度；提高流速－小颗粒填料的保持柱效，不降低分离度；提高速度的辅助手段：温度2、提高分离度和灵敏度提高L/dp（dp变小）－提高柱效－提高分离度在RRLC系统上可以实现HPLC分离,此外还可以大幅度缩短分析时间，降低溶剂消耗，大大提高工作效率。与HPLC相比，在保持相同进样量的前提下，使用小颗粒填料的RRLC可以显著改善分离灵敏度。温度对RRLC分离影响较大，可通过调节温度改善分离度，或加快分离速度，节约时间填料粒径进一步减小增大柱效，进一步提高灵敏度和通量。提高温度（流动相的粘度和温度成正比，适当的提高温度可进一步降低压力，同时温度升高有利于传质、加快吸附脱附平衡均可以带来柱效的进一步提高。8液质中常见的离子源及其特点，并简述用于液质的流动相需注意的问题答：根据化合物的性质，选择离子源：分子量、极性、挥发性、热稳定性等。样品分子极性强（如有机酸碱），建议采用ESI电离方式。化合物极性低，可采用APCI电离方式（如甾体化合物）。大气压电离(API)离子化过程发生在大气压下(与在真空下的电离有本质的不同,例如,EI－电子轰击离子源)API（大气压电离）技术包括：ESI-电喷雾离子源APCI-大气压化学电离源大气压化学电离源主要用来分析中等极性的化合物，有些化合物由于结构和极性方面的原因，ESI不能产生足够强的离子，可以采用APCI方式增加离子产率。APCI主要产生的是单电荷离