色谱法详案

教案（详案）课程名称：生物药物分析课程性质：专业必修课适用专业（方向）：生物制药专业总学时：36学时使用教材：生物药物分析开课单位：生命科学与技术学院授课教师：谭承佳（助教）授课班级：生物制药05级3班开课时间：2007-2008学年上《生物药物分析》授课教案课程生物药物分析班级生命科学04级1-2班学期2006-2007-1课时2学时教师谭承佳上课日期每周4第3.4节课程类型理论课程名称（章、节）第七章色谱法第一节色谱法概述教学目的、要求使同学了解纸色谱、薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱在生物药物分析中的应用和含量测定方法教学重点薄层色谱、高效液相色谱的基本原理及操作教学难点薄层色谱、高效液相色谱的基本原理及操作技术主要教具设备材料投影仪、电脑、常规教学设备。思考题1概念：色谱法2色谱法的基本原理？教学过程安排引入复习：1生物药物的概念（提问）同学们好，在进入新内容的学习之前，我们先来回顾一下前面的内容，在绪论里我们已经了解了生物药物分析的基本任务是鉴别各种生物药物的化学成分、化学结构、测试样品质量、多组分药物的组分含量、相关物质和降解产物含量等。生物药物主要包括蛋白质、氨基酸和多肽、酶类以及多糖、甾体类，对这类药物的分析除常规方法外还需具专属性的，我们在前几章已经学习了酶法、酶联免疫法以及电泳法等特殊分析方法，今天我们将学习药物分析中应用广泛的色谱法。（教师讲授）引入：色谱法及其色谱法原理在日常生活中的应用？（提问）2min授课内容（一）概述：一色谱法的由来及其概念（教师讲授）1903年俄国植物学家Tsweet将碳酸钙装填在玻璃管(也称为色谱柱，Column)内，石油醚洗脱，用于分离植物叶子中的叶绿素，植物叶子的提取液在通过柱子后，在柱床上出现了不同颜色的色带，因此他将这种方法命名为色谱法(Chromatography)。这就是最早使用的柱色谱法。色谱法（chromatography）利用物质的物理化学性质建立起来的分离、分析方法。广泛用于复杂化合物的分离分析。实质：分离；目的：定性或定量分析二色谱法的发展（教师讲授）30、40年代相继有了薄层色谱法和纸色谱法。1942年瑞典科学家Tiselins因电泳和吸附分析的研究获诺尔奖金。50年代英国生物化学家Martin在研究液液分配色谱的基础上建立了气相色谱法并且提出了色谱分离的塔板理论，Martin由于对气相色谱法的贡献获得诺贝尔奖金。60年代后期出现了高效液相色谱法。70年代末发展了气相色谱-质谱联用技术、液相色谱-质谱联用技术。色谱法经历了近百年的发展已经由分离向分离、分析的，色谱法在药物分析领域占有重要地位，已成为我国药物分析论文中使用频率最高的一种分析方法，在质量标准中的应用也迅速增加。三色谱法的原理（示意图）（教师讲授）基于组分通过互不相溶的两相而达到分离：样品溶解在流动相(MobilePhase)中，从装填在柱子中或涂渍在载体表面的固定相(StationaryPhase)上通过，依据组分与固定相之间的相互作用力的不同，经过充分的运行时间，即被分离。色谱法是一种分离技术，这种分离技术应用于分析化学中，就是色谱分析。四色谱法分类15minA+B+CCCBCBACBAABC流动相色谱法种类很多，通常按以下几种方式分类。1．按两相状态分类在Tswett的实验中，碳酸钙是固定不动的，称为固定相；石油醚是流动的，称为流动相。根据流动相状态，流动相是气体的，称为气相色谱法；流动相是液体的，称为液相色谱法。若流动相为超临界流体，则称为超临界流体色谱法。根据固定相状态，是活性固体（吸附剂）还是不挥发液体或在操作温度下呈液体（此液体称固定液，它预先固定在一种载体上），气相色谱法又可分为气固色谱法和气液色谱法；同理，液相色谱法也可分为液固色谱和液液色谱法。2.按分离原理分类色谱法中，固定相的性质对分离起着决定性的作用。根据不同组分在固定液中溶解度的大小而分离的称为分配色谱。气相色谱法中的气液色谱和液相色谱法中的液液色谱均属于分配色谱。根据不同组分在吸附剂上的吸附和解吸能力的大小而分离的称为吸附色谱。气相色谱法中的气固色谱和液相色谱法中的液固色谱均属于吸附色谱。3.按固定相的形式分类固定相在柱内的称为柱色谱，柱色谱有填充柱色谱和开管柱色谱。固定相填充满玻璃或金属管中的称为填充柱色谱；固定相固定在管内壁的称为开管柱色谱或毛细管柱色谱。固定相呈平面状的称为平板色谱，平板色谱有纸色谱和薄层色谱。前者以吸附水分的滤纸作固定相，后者以涂敷在玻璃板上的吸附剂作固定相。4．按固定相材料分类根据固定相材料的不同进行分类。以离子交换剂为固定相的称为离子交换色谱。以孔径有一定范围的多孔玻璃或多孔高聚物为固定相的称为尺寸排阻色谱。采用化学键合相（即通过化学反应将固定液分子键合于多孔载体，如硅胶上）的称为键合相色谱。（二）纸色谱法一分配色谱原理：以一种多孔性的物质表面吸附一种具有黏度的有机相液体，该液体在色谱传递过程中始终固定在支持体上，构成色谱分离的固定相。另一互不相溶的溶剂作为流动相进行洗脱。分配系数：待分离物质在两项中的溶解度之比比移值：原点到斑点距离与到溶剂前沿的距离之比二影响因素：物质极性、溶剂、PH值、滤纸以及时间、温度、显色条件三纸色谱的应用：混合氨基酸的分离鉴别（三）薄层色谱法一薄层色谱的应用（教师讲授）二薄层色谱的基本原理薄层色谱法是将细粉状的吸附剂或载体涂布于玻璃板、塑胶板或铝板上，成一均匀的薄膜，经点样、展开与显色后，再与适宜的对照物质按同样的方法所得的色谱图作对比，用于药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。5min15min1.吸附剂吸附剂的性质：活性：保留溶质组分的程度白色、内部多孔、吸附表面、吸附解吸附常用的吸附剂：硅胶、氧化铝、聚酰胺、纤维素、凝胶吸附剂的选择：样品性质：酸碱性、脂溶性、水溶性吸附剂性质：活性、化学反应性、物理性质2.展开剂展开剂的选择要求：能溶解待测组分（极性）能分离待测组分与杂质（选择性）展开斑点圆整集中、Rf值适中化学反应性弱沸点、黏度适中极性：己烷＜石油醚＜二硫化碳＜苯＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水3.色谱参数定性参数：Rf值；相平衡参数：K；分离参数：R二、薄层色谱的基本操作（动画）制板、点样、展开、显色的操作及注意事项1．选择固定相：一般固定相的载体都是大小均匀、粒度较小的固体，常见的如：硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺、葡聚糖凝胶等。根据不同的待分离样品选择适当溶剂。2．制备薄板：薄板一般为玻片、塑料片或铝箔，采用涂布器将载体均匀的涂布到薄板上。3．点样：定性采用普通毛细管点样、定量应用微量注射器或微量定量毛细管4．展开：根据薄层板的尺寸及展开方式选择不同尺寸规格展开槽，一般有水平室、直立式两种5．斑点定位：展开后薄层板上被分离的成分一般不可见，那么我们就必须采用适当方法使斑点显示或可见，通常有以下一些方法，光学检测、蒸汽显色、试剂显色、生物自显影或放射自显影等。6．定性检测及定量分析：分离及定位完成后根据斑点位置和定位颜色等因素对组分进行定性分析，采用薄层扫描仪对斑点进行扫描，根据斑点面积或扫描峰高对成分进行定量分析三、常见问题及消除1．斑点拖尾(酸碱环境)2．斑点圆整度差（点样、展开系统选择）3．边缘效应（预饱和、展开系统）4．Rf值重现性差(规范展开条件)（四）高效液相色谱（教师讲授）通过比较经典柱色谱、气相色谱与高效液相色谱，总结高效液相色谱的特点，即高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器一、基本原理（出示图片）液相色谱分离系统由两相——固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。二、高效液相装置图高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成（出示图片）分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的30minAABCCBACBCBCt，minABC信号A+B+C储液器高压泵梯度洗脱装置馏分收集器记录仪检测器色谱柱进样器流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。1、高压输液系统高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。1）.溶剂贮存器溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。2）.高压输液泵高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。3）.梯度洗脱装置梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类：一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。2、进样系统进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。3、分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2~6mm，柱长为10~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。4、检测器检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。三、高效液相色谱分类1．反相色谱2．正相色谱3．离子交换色谱4．分子排阻色谱四、色谱方法学根据样品性质选择色谱分离类型以及流动相的组成、配比，通过对色谱条件的系统适应性考察后，测定样品，并处理色谱数据，计算样品含量。五、总结高效液相色谱应用领域（五）气相色谱法应用特点高分离效能、高选择性、高灵敏度、高分析速度、应用广泛8min小结一、色谱法的分类二、薄层色谱原理及操作要点三、高效液相色谱分类、原理及操作要点四、色谱法在生物药物分析中的应用5min实施情况分析教学效果：学生的知识掌握程度：学生提出的问题：1、2、3、4、教学中最满意的地方：教学中最不满意的地方：