细胞观察与分析-细胞工程课程

细胞工程课程细胞计数与活力分析采用血细胞计数法计数，结果以每毫升细胞数表示。可以采用0.1%（生理盐水配制）浓度的结晶紫染色细胞计数。该染料对死、活细胞均着色，因此能测出细胞总数。细胞群体中总有一些因各种原因死亡的细胞。总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。由组织中分离细胞一般要检查活力，以了解分离方法对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。台盼蓝染色法用0.5%浓度的台盼蓝（Trypanblue）（PBS配制）只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞；活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。MTT（甲基噻唑基四唑，Methylthiazolyltetrazolium）法利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应测定细胞相对数和相对活力。四唑盐是一种接受氢离子的染料，活细胞中琥珀酸脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲暨（Formazan)，并沉淀在细胞内和细胞周围中。甲暨是含H2N—N=CH—N=NH结构的化合物的总称。甲暨结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将四唑盐还原。还原生成的甲暨结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH4.7）的溶液中溶解，也可以用DMSO来溶解。利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，可反映出活细胞数目。细胞活力以活细胞占计数细胞总数百分比来计算。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等方面。需要注意的是：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数；MTT粉末和溶液都需要避光保存。3.4.2细胞固定与染色观察3.4.2.1细胞固定细胞除了可直接进行观察外，还可以用细胞固定方法将细胞制成标本进行观察。固定染色观察既可显示细胞形态，也可揭示细胞的微细结构，是细胞培养中常用的观察技术。细胞固定常用的固定剂有：（1）甲醇/醋酸：浓度为3：1，现用现配，适用于观察染色体和Giemsa染色。（2）FAA固定液：80%酒精90.0mL，冰醋酸5.0mL，中性福尔马林(40%甲醛，使用时加过量MgCO3中和)5.0mL。细胞工程课程（3）Carnoy是较好的非水溶性固定液，含纯酒精60.0mL、氯仿30.0mL、冰醋酸10.0mL，适用于显示细胞化学成分，但是穿透力较差。3.4.2.2细胞染色H．E(苏木精一伊红)染色法H．E染色法是细胞化学染色方法中最常用的一种方法。其基本原理是用碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像，并能达到良好的核质对比染色。染色过程为：样品制备、染细胞核、染细胞质、脱水、透明和封固等。Giemsa染色法Giemsa染色是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。Giemsa染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，细胞质染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。缓冲液pH值要准确，否则影响染色效果。用染色缸染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化后，再进行染色。染色完毕将标本浸入水中洗除染液。Feulgen染色法福尔根(Feulgen)于1924年建立了Feulgen染色法，能对DNA进行特异性染色。基本原理是：细胞中的DNA在60℃时用1NHCl会解离脱氧核糖核酸，使嘌呤碱基与糖苷键被破坏，嘌呤碱脱掉，脱氧核糖中的醛基游离，醛基能与Schiff试剂相结合，形成一种紫色的复合物。本方法中离解是关键，温度过低或酸度不够，醛基暴露不充分，染色会过浅；反之，酸解过度会导致DNA完全解聚，染色反应会减弱。细胞中RNA对酸比较稳定，醛基难游离，不被着色，因此染色后，细胞核成粉红色至紫红色，胞质为无色。考马斯蓝(Coomassiebrilliantblue)染色法这是一种显示细胞骨架、细胞内微丝的染色方法。免疫荧光法（Immunofluorescencemethod,IF）基本原理是：将已知抗体或抗原标记荧光素，浸染含有相应抗原或抗体的组织细胞标本，借助抗原抗体的特异性结合，抗原或抗体的存在部位呈现荧光，从而可以定位标本内的抗原或抗体。此种染色法在荧光显微镜下观察，阳性部位出现荧光。荧光素种类不同可出现不同颜色的荧光。免疫过氧化物酶染色法(Immunoperioxidasestainingmethod)卵白素—生物素—酶复合物法是目前最敏感的细胞免疫化学染色法之一。其基本原理是：将特异性第一抗体与组织细胞相应抗原结合后，通过生物素化桥抗体与第一抗体结合，借助卵白素与生物素的天然亲和性将生物素化辣根过氧化酶连接为复合物，通过酶促反应，显示组织细胞相应的抗原。此法灵敏性高，对比度佳。细胞工程课程凋亡细胞观察细胞有一定寿命，总有细胞不断衰老、死亡，同时又有细胞增殖。细胞凋亡的检测对于体外培养细胞、研究细胞生理生化活动具有重要意义。3.4.3.1细胞形态观察根据凋亡细胞固有的形态特征可以检测细胞凋亡。普通光学显微镜和倒置显微镜观察凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象。染色质浓缩、边缘化，核膜裂解。呈现块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO33342(Hoechst33342)、HO33258(Hoechst33258)、DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。3.4.3.2生化分析磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。锚定蛋白（AnnexinV）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS特异性结合。将锚定蛋白进行荧光素（FITC、PE）或生物素（biotin）标记后，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidineiodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对于凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将锚定蛋白与PI结合使用，就可以将凋亡早期、晚期的细胞以及死亡细胞区分开来。3.4.3.3分子技术细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA断裂形成50-300kbp长的DNA大片段或者180-200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱。对于大片段DNA分析通常采用脉冲场电泳分析。细胞工程课程染色体分析染色体是细胞分裂时期遗传物质存在的特定形式，是染色质紧密包装的结果。染色体分析大致经过如下四个步骤：（1）样品处理：采用秋水仙素抑制细胞分裂时纺锤丝的形成，使细胞处于分裂中期。此时染色体达到最大浓缩，具有典型的形态。动物可以活体注射，植物组织可以直接浸泡处理。（2）低渗处理：采用低渗透压溶液处理处于分裂中期的细胞，使细胞膜涨破，染色体分散。（3）固定化：采用醋酸、甲醇等细胞固定液制片。（4）染色观察：采用染色液染色观察。