花药培养及其应用2

植物细胞和组织培养（PlantCellandTissueCulture）是一种利用离体培养细胞实现植物快速繁殖和品种改良的生物技术。细胞组织培养在细胞或亚细胞的水平上进行遗传操作,并不涉及重组DNA和有害外源基因的导入，不存在生物安全问题，所以它是一种安全的或者“绿色的”生物技术，一直受到人们的关注。1902年Haberlandt发表了著名论文《植物细胞离体培养实验》,指出:作为高等植物的器官和组织基本单位的细胞有可能在离体培养条件下实现分裂分化，乃至形成胚胎和植株。这种见解后来被称为细胞全能性学说（celltotipotency）早期研究历史1951年Skoog和Tsui（崔澂）采用加有IAA和腺嘌呤的培养基,使烟草茎段的髓组织的细胞分裂和生长，并且分化形成不定芽。这是人类第一次从离体培养的植物组织诱导出芽和植株。1955年Miller等从DNA的降解产物中分离出6-呋喃氨基嘌呤，发现它不仅可以代替腺嘌呤诱导烟草茎段分化芽，而且诱导芽分化的效力比腺嘌呤高三万倍，为诱导离体细胞的器官分化提供了有效的方法。1958年Steward导单个来自胡萝卜根的悬浮细胞发育为成熟的胚胎，完全证明了Haberlandt提出的细胞全能性学说。至今已经在一千多种植物上，从各种类型的组织和细胞，甚至原生质体，诱导出胚胎和完整植株，从而为细胞工程研究和应用奠定了坚实的基础。植物细胞组织培养研究主要领域１．植物细胞工程的理论基础：细胞全能性２胚培养和胚乳培养３．植物组织培养脱毒快速繁殖４、体细胞胚胎发生与人工种子５．体细胞无性系变异与育种６．原生质体培养和体细胞杂交７．花药和游离小孢子培养８．植物细胞大量培养和次生代谢产物利用参考书：朱至清，植物细胞工程，化学工业出版社，２００３。孙敬三、朱至清，植物细胞工程实验技术，化学工业出版社，２００６。花药培养及其应用朱至清（中国科学院植物研究所）一、花药培养诱导单倍体植物在植物学上，通常将具有两套染色体的植物叫做二倍体，二倍体植物有性过程产生的花粉（小孢子）和卵细胞分别具有一套染色体，被称为单倍体。在自然或人工条件下由单倍体的花粉（小孢子）或卵细胞发育成的植物就是单倍体植物。所谓花药培养，就是在离体培养的条件下使植物花药中的花粉（小孢子）脱离原来的发育方向，经过胚状体或愈伤组织途径形成单倍体植株的过程。50年前，1964年印度学者Guha和Maheshwari首先从离体培养的曼陀罗花药中诱导出单倍体花粉植株，至今已整整50年了。二、单倍体植物的特点单倍体植物的最大特点是高度的不孕性,这是由于它只有一套染色体，没有同源染色体，在减数分裂时只有单价体，无法进行联会，造成染色体行为的不规则，形成的大孢子或小孢子染色体不齐全，因此完全失去有性生殖的能力。但是如果将单倍体植物的染色体数目加倍，即可获得加倍单倍体植株（DoubledHaploid,简称DH植株），即纯合二倍体植株或纯系。快速获得纯系在育种上具有广泛的应用价值。三、单倍体植物在育种上的应用1.加快常规育种的速度：从杂种F1代花药培养产生加倍单倍体（DH）植株即可形成纯系，快速选出新品种。2.有利于隐性性状的表现：隐性优良性状在DH系中充分表现有利于选择。3.快速获得自交系：DH系相当于高度纯合的自交系，可用于玉米等作物的杂交种制种。4.诱导超雄植株和全雄性杂种5.单倍体细胞突变体筛选6.利用DH群体绘制遗传图谱EggmMmMale(Mm)Female(mm)anther/microsporecultureDHplantsFemaleSuperMale(MM)(mm)sexualproductionMale(Mm)50%50%100%Microspore/SpermProductionofSuperMalePlantsandItsApplicationinAsparagusAsparagusGuelphMilleniumFemalexDHsupermaleCanadaDaveWolynAndréasDHfemalexDHsupermaleFranceCorriolsetal.,1990RingoDHfemalexDHsupermaleItalyFalavignaetal.,1999GoliaDHfemalexDHsupermaleItalyFalavignaetal.,1999ArgoFemalexDHsupermaleItalyFalavignaetal.,1999ErosFemalexDHsupermaleItalyFalavignaetal.,1999CropCultivar/lineMethodCountryAuthorityReference/pers.com.GladioFemalexDHsupermaleItalyFalavignaetal.,1999HybridproducedwithDHsupermaleinAsparagus6、利用DH群体绘制遗传图谱DH群体(doubledhaploidpopulation,加倍单倍体群体)是以F1代为材料进行花药培养获得的加倍单倍体植株的分离群体，DH群体可以通过自交繁殖长期保存，重复使用，因此是理想的遗传作图群体。1992年遗传所陈英等用花药培养构建了籼粳杂种窄叶青(籼稻)×京西17(粳稻)的DH群体，该群体由127个DH植株构成。利用该群体朱立煌等构建了水稻遗传图谱。陈洪等（1995）首先用52个RAPD标记建立了水稻的RAPD标记连锁图谱，该图谱覆盖基因组总长度为898.4cM,标记间平均距离为17.3cM。后来徐云碧等（1998）将89个微卫星标记定位在已有的遗传图谱上。沈利爽等（1998）利用该群体构建了含有444个标记的分子连锁图谱，其中包括276个RFLP标记，34个RAPD标记，89个微卫星标记，10个AFLP标记，26个端粒重复相关序列标记和9个同工酶标记，这个较高密度的分子图谱为基因定位的准确性提供了保障。朱立煌等还利用此图谱进行了抗白叶枯病基因的定位和克隆的研究。已知窄叶青具有抗白叶枯病的基因，在该DH群体中抗白叶枯病基因的分离表现为1：1，因此可以根据DH群体中每个个体的抗病表现，将它们分为两个基因池，即抗病基因池和敏感基因池。然后用150个RAPD引物对每一个体的DNA进行扩增，发现扩增产物BP127和BP183只存在于抗病基因池。进一步分析表明产物BP127与抗白叶枯病基因连锁，利用BP127与窄叶青DNA杂交，获得两个序列。他们进一步与美国康奈尔大学合作，利用Danksley的SL作图群体，将序列1定位于水稻第8染色体，而序列2被定位于第1染色体。进一步的RFLP连锁分析确定抗白叶枯病基因位于分子标记BP127和RZ617之间的长度为2.4cm的区域，并在此基础上克隆了水稻的抗白叶枯基因XA21。国外研究者分别构建了大麦、小麦和青椒等植物的DH群体，已经被普遍采用作为构建遗传图谱的模式群体。Uptonowmorethan200cultivars,hybridsorlineshavebeenselectedfromDHplantsderivedfromantherormicrosporecultureinEuropeandChinaRICENEWCULTIVAR“ZHONGHUA9”BYLI(1990)INBEIJINGCHINA四、影响花药培养成功率的因素离体培养的小孢子以胚胎发生或器官发生方式产生植株。在器官发生情况下，小孢子首先形成愈伤组织，然后分化出苗和根，成为植株。影响培养花药中小孢子胚胎发生或愈伤组织形成的主要因素有：供试材料的基因型，供体植株的生长条件和状态，花粉（小孢子）的发育时期，培养基组成，供试材料的预处理，以及培养条件。(1)供试材料的基因型在小麦、大麦、水稻、玉米和油菜等植物的花药培养中证实，供试材料的基因型显著影响花粉植株的诱导率。某些品种、品系甚至单株的花粉植株产量明显高于其他的材料。因此在初次开展花药培养或和游离小孢子培养时，最好采用多种基因型的材料进行比较实验。下图是我们在进行小麦花药液体-固体双层培养时观察到的不同杂种组合花药产生花粉植株能力的差异。F1（ERIKXHY320)的绿色花粉植株诱导率最高；品种Nostar能产生愈伤组织，但只分化白色花粉植株；而品种Norwin只产生愈伤组织，不能分化植株。(2)供体植株的状态在欧洲油菜和白菜型油菜花药或游离小孢子培养中发现：1、供体植株生长在较低的温度下有利于花药和小孢子培养，供体植株可以在取材料前放置在5-10度下数天。2、供体植株以较低的密度种植为好。3、较老的供体植株上采取的花药或小孢子产生胚状体的能力较强。(3)花粉发育阶段只有处于特定发育阶段的花粉（小孢子）才具有胚胎发育的潜能.在水稻、大麦和玉米上，单核中晚期的花粉最适合用来进行花药或游离小孢子培养，。甘蓝型油菜（Brassicanapus）和白菜型油菜(B.campestris)的花粉胚主要来源于单核晚期到双核早期的花粉.通常花粉的发育阶段与花芽的形态和大小相关联，可以通过显微镜检查确定与适合培养的花粉（小孢子）阶段相对应的花芽形态特点，以此做依据选取花芽中的花药进行培养。(4)培养基组成花药培养基由水、无机盐、碳源（糖类）、维生素、氨基酸和生长调节剂等组成，培养基成分的变更会显著影响花粉胚或花粉愈伤组织的诱导频率。培养基中的无机氮源分为铵态氮(NH4+)和硝态氮(NO3-)两类。试验表明，高含量的铵态氮会抑制花粉胚的形成，因此花药和小孢子培养大多采用铵态氮含量较低的培养基，如B5(Gamborgetal.,1968),N6(Chuetal.,1975),FHG(Hunter,1988),NLN(Lichter,1981)andCHBmedium(Chuetal.,1990)以及1/2MS培养基。碳源（糖类）是另一个显著影响花药和小孢子培养效率的因素。蔗糖是最常用的碳源，通常用于烟草、油菜和水稻的花药培养。但是对于大麦、小麦和玉米，麦芽糖和葡萄糖被证明是更好的碳源。当用葡萄糖做碳源时，培养基需要过滤消毒，因为它在消毒过程中会产生对植物细胞有害的物质。糖类的浓度也很关键，花药培养，特别是游离小孢子培养采用较高的糖浓度，以便维持较高的渗透压使小孢子能够存活。例如在白菜型油菜（B.campestris）上,小孢子培养先使用含17%蔗糖的NLN培养基培养两天，然后再转入含10%的NLN培养基。其他因素如生长调节剂，维生素、有机附加物也是重要的培养基成分，它们根据不同的培养目的有选择地被采用。活性炭有时被加入到分化培养基中，以防止培养组织褐化。促进植株生长（右下）。在油菜花粉胚培养基中有时加入一定分子量的聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG），用来促进花粉胚的正常发育和转变成绿色（左下）(Ilic-Gruboretal,1998;Baillieetal.,1992).(5)预处理和预培养花药或小孢子的预处理或预培养可以增加花粉植株的产量，通常有三种预处理方法：:•花芽在5-8C中预处理3-7天（小麦、水稻和烟草）•游离小孢子在35C预培养2天（油菜）•花药在0.3M甘露醇溶液中预培养3天（大麦）(6)培养条件一般说来离体培养花药或游离小孢子适合在弱光或散射光下。培养温度随植物种类不同略有差异.据文献资料一些植物花药培养最适温度如下:五、花药与小孢子培养的方式（1）花药固体培养将离体花药接种在用琼脂固化的固体培养基上，待花粉胚或花粉愈伤组织出现后，将它们转移到分化培养基上诱导花粉植株。获得的小植株有时还需要转移到壮苗培养基上诱导生根和壮苗，再转移到土壤中栽培。（2）花药液体漂浮培养在小麦、大麦和茄子等植物上，可以将离体花药接种在液体培养基上，花药漂浮在液体表面。待花粉胚或花粉愈伤组织出现后，将它们转移到固体培养基上诱导花粉植株。液体培养的优点是操作比较简便，而且可以避免琼脂中杂质对花药培养的不利作用。1.小麦花药漂浮培养程序(Chuetal.,1990)(1)选取小孢子处于单核中晚期的被旗叶鞘包裹的幼穂。(