线粒体DNA疾病

线粒体DNA疾病和生殖技术发展的意义张文敬2015602591杨永妍2015602337丁艺洁2015602756杨陈祎2015602340引言线粒体DNA疾病线粒体是真核细胞内重要的产能细胞器。线粒体疾病是一种病理状态，在这种状态下，线粒体的产能能力受损，并且不能完成其正常功能。这类疾病是相对比较常见的，但是却很少有这样的诊断，因为大多数患者仅表现出非常轻微的症状（曼瓦林等，2007）。和线粒体疾病相关的症状严重性的不同范围使得其被报道的流行率变异性很大：例如，有一种线粒体的病理学改变（下文所讨论的线粒体基因3243A→G的突变）的流行率是1到300之间（曼瓦林等，2007），也有一种观点认为是1到14000之间（钦纳里等，2000）。线粒体内自身存在DNA（后文称mtDNA），是人体内唯一存在于细胞核外的DNA。线粒体DNA比较特殊的是它有自己的基因序列和核糖体亚型。它编码产生呼吸链中所需要的少数亚单位，而呼吸链是由多个多聚体蛋白依次排列于线粒体膜上形成的一个产能链，此外它还编码产生转运体RNA和核糖体RNA。呼吸链中大部分的必需蛋白质是由细胞核所编码产生的，很多蛋白质同样也需要线粒体DNA来维持和复制。因此无论是线粒体DNA还是细胞核内DNA，其突变就有可能导致线粒体功能的病理性缺失，导致线粒体疾病（泰勒和特恩布尔，2005；格里弗斯等，2012）在这篇综述中，我们将重点讨论由线粒体DNA突变所引起的疾病。线粒体DNA是母系遗传的，原因很明显，在形成受精卵时，精子不携带细胞质成分，来自父亲的线粒体在卵子受精后即泛素化（Sutovsky等，1999,2000）并被靶向破坏（康明斯等，1998；史特拉等，2000；艾拉维等2011；SatoandSato,2011;德卢卡和奥法雷尔，2012），仅在异常的胚胎中或种间交配的情况下尚存在（乔伦思丹等，1991；圣约翰等，2000）。线粒体DNA甚至有可能在受精之前就已经被消除了（卢奥等，2013)。线粒体DNA突变引起的疾病在发病、严重程度和遗传性方面有其独特的特点，很大一方面原因就是在典型的有核细胞中，其线粒体DNA有数以千计的复制体，（Lightowlers等，1997；华莱士，1999）。从遗传学上来讲，多数正常细胞内的线粒体DNA实际上是相同的（这在医学上称为“同型异源性”）。在线粒体DNA疾病中可能存在大量不同的、突变的DNA分子，从而产生了“异质性”（在同一个线粒体中同时存在多种类型的线粒体DNA）。线粒体DNA是母系遗传的，使得其成为只在母系中遗传为特点的疾病。线粒体DNA单倍体能够调节由细胞核编码的基因突变造成的病理影响（施特奥斯等，2013），这种线粒体DNA的变异性也依据其背景及环境产生利弊不同的影响（治等，2012）。很多线粒体疾病具有异质性，即变异的和原株线粒体DNA共存于受损细胞内。大多数实例中观察到突变量的影响（杰普森等，2006）：线粒体DNA突变体的比例，复制量及其分布影响组织的功能（Petruzzella等，1994）。在最常见的疾病当中，当线粒体DNA突变达70%，线粒体DNA疾病开始出现临床症状（杰普森等，2006）。这种取决于突变量的特性是很重要的，因为从动态学上讲，细胞内线粒体DNA的量及成比例的突变体会随着发展而不断改变，这在当前是很难描述的。线粒体DNA数量的不断变化意味着：随着突变的线粒体DNA在组织中不断积累，线粒体DNA疾病患者常会出现先兆症状（波尔顿等，1995；韦伯等，1997）。例如，患皮尔逊综合症的孩子在婴幼儿初期可能会出现贫血和乳酸血症。这种特征性的变异是由线粒体DNA5000的碱基对中单个的缺失引起的，其中包含蛋白质和转运体RNA编码区。最初，这些孩子组织内的线粒体DNA突变水平很高，随着疾病的进展，血液中突变水平下降，贫血也逐渐好转。然而，如果他们能活到青春期，随着肌肉中线粒体DNA突变比例的升高，他们可能会患上肌病（麦克沙恩等，1991）。而在大多数母系遗传的异质性线粒体DNA疾病中，线粒体DNA数目的变化不是那么极端的：几乎在所有的案例中，血液中的线粒体DNA突变水平都比像肌肉和大脑这样有丝分裂后的组织中低（拉赫曼等，2001）。这个例子阐明了一个潜在的诊断上的问题：突变量随时间不断改变，则很难利用血液中线粒体DNA的水平对患者提出关于预后和传播风险的建议。线粒体疾病常常是具有临床异质性的。而很多患者不符合某些特殊的临床症状，众所周知的线粒体DNA疾病的例子有：MIDD（线粒体遗传性糖尿病伴耳聋）（范登奥维兰等，1992），MELAS（线粒体肌病，脑病，乳酸血症，卒中样症状）（戈托等，1990），MILS（母系遗传的Leigh氏综合征）（霍尔特等，1990），MERRF（肌阵挛性癫痫伴肌肉破碎红纤维综合症）（华莱士等，1988b），LHON（Laber氏遗传性是视经病变）（华莱士等，1988a;霍厄尔和麦卡洛，1990；约翰等，1992），MELAS（Clafaloni等，1992）和MERRF都有一个较重要的特征：肌肉功能障碍，都能引起认知能力下降，共济失调，癫痫症，心肌病和耳聋（钦纳里等，1997）。糖尿病是MELAS常见的特征（范登奥维兰等，1992）。MILS主要涉及中枢神经系统：精神运动的延迟，视力和听觉损害（迪高等，1995）。LHON常常是一种无症状的视神经病变，且很多患者的突变线粒体DNA是同质的（霍厄尔和麦卡洛，1990；约翰等，1992）.据研究，某些疾病是由特殊的线粒体DNA突变引起的，如：m.3243AG线粒体DNA突变常导致MIDD，但是在比较严重的MELAS病例中（戈托等，1990），m.8344AG线粒体DNA突变会导致MERRF（华莱士等，1988b）,m.11778GA(华莱士等，1988a),m.3460GA(霍厄尔和麦克洛，1990)和m.14484TC(约翰等，1992)的线粒体基因突变会导致LHON。然而导致这些疾病的还有其他一些线粒体DNA突变。钦纳里，哈德逊（2013）和迪莫罗（2013）等对线粒体DNA突变的临床特点和发病微点图进行过综述。线粒体DNA疾病遗传的另一个显著的特点即母亲和后代之间异质性发生很大变化。例如，一个表型正常的母亲，有50%的突变线粒体DNA，那么她所生的孩子可能是健康的，也可能患有严重的线粒体疾病（拉尔森等，1992）。后代之间产生这种不同的原因即所谓的“瓶颈”效应，就母亲的异质性而言，后代之间的异质性水平有显著的差异，而后代之间异质性的平均水平与母亲的异质性则相差无几（吉努斯等，1996）。这种效应的潜在机制仍在热议中（卡琳等，2011），一些人认为原因在于生殖系中线粒体DNA复制量显著降低（克里等，2008），另外有人认为在于细胞分裂时线粒体DNA的随机分配（曹等，2007，2009），还有人认为是线粒体DNA在不断发展中部分复制引起的（韦等，2008）（图1）。这个障碍中的极少数案例，母亲和孩子之间可能会由一种几近同质的线粒体DNA类型快速转变为另一种类型。通过对非编码区线粒体DNA（马丁顿等，1997）不同长度变异体的研究，现在有学者（JP）在母体的卵母细胞和鼠的卵母细胞中发现了这种转变的证据。在具有异质性的致病线粒体DNA突变体的妇女的卵母细胞中，这种转变也是非常明显的（波洛克等，1997；马丁顿等，1998；布朗等，2001）。尽管这种机制的阐明仍待进一步研究（卡琳等，2011），这个“瓶颈”是不断发展的现象形成一定量的胞内线粒体DNA的明确的例子。尽管有几种有希望能改变患有异质性疾病患者体内突变线粒体DNA数量使其降低到低致病水平的方法，线粒体DNA疾病现在仍无法直接治愈。例如，一些特殊设计的核酸酶（包括所谓的线粒体靶向的转录激活因子样效应物核酸酶（贝克曼等，2013）和锌指核酸酶（甘米奇等，2014））能够在突变位点上将突变的线粒体DNA剪切掉。由于临床上缺乏对线粒体DNA疾病有效的治疗，为了防止这类疾病向下一代的传播，让患有亚临床线粒体DNA疾病的妇女能拥有健康的孩子（或者至少提高它的可能性），相应的策略是极其重要的（图2）。我们将那些已经应用于临床实践中的策略定义为“传统疗法”，将那些还未经临床证实应用于人体的治疗方法成为“现代疗法”。传统的疗法旨在将患者体内的异常卵母细胞完全清除或监视胚胎/胎儿的异质性。现代疗法目的是清除变异的线粒体DNA。这些新的方法在科学著作和媒体中都成为热点。“就像给电脑换电池一样”（指的是将功能异常的线粒体DNA清除掉）和与之相关的“有三个父母的婴儿”（指的是在一个胚胎中出现第三方的线粒体DNA；见下文），这些吸引人的标语引起很多人的兴趣包括科学界交流到普通大众，并且其中有人最近指出：目前针对线粒体DNA疾病遗传性的治疗方法很快将应用于临床。生殖途径治疗mtDNA疾病的经典理论自从25年前首例母系遗传mtDNA疾病报道以来(Wallaceetal,1988b)，共出现三个较为有名的理论方法来解决突变线粒体基因的家族遗传问题(SauerandKavic,2006)。卵母细胞捐献是一种可以完全去除突变线粒体基因遗传可能性的简单方法。这种方法以捐献的健康卵母细胞代替有突变线粒体基因的卵母细胞。这种方法的弊端是生母的遗传特征会完全丧失，但这也是唯一一种能够保证没有遗传风险的方法。另一种方法是从待孕母亲的瓶颈期卵母细胞中选择出突变量较低的胎体。这种方法只可以用于异质型mtDNA疾病。筛选低风险胎体在孕初期实施（绒毛膜取样）(Hardingetal.,1992)。在第一孕程终期检测分析绒毛膜异质性，若胎儿基因呈现出高度异质性，其患有mtDNA疾病的可能性极高，可此时终止妊娠。当疾病的显相与否和突变程度密切相关时，这种方法可以有效解决mtDNA疾病的遗传问题(Whiteetal.,1999)。而对同源异质性疾病或者疾病显相与突变程度相关性较低（例如LHON）时，这种方法则不适用(Blacketal.,1996)。此外，如果滋养层mtDNA的突变程度对其他孕体不具有代表性，其有效性也会明显降低。这种情况出现在复制分裂开始较早时，下文会有所叙述。第三种治疗方法需要通过胚胎着床前的基因诊断筛选出低风险的早期（卵裂）胚胎。卵子受精并经过短暂发育后，从胚芽中取1-2个细胞分析mtDNA突变程度。在这个阶段，每个卵裂球之间的突变差异很小。胚胎的突变程度可以用来估计个体mtDNA疾病的后天风险(Poultonetal.,2010)。这种方法是目前临床上应用的主要方法，成功用于有mtDNA遗传疾病的家庭(Steffannetal.,2006;Monnotetal.,2011)。然而，当着床前基因诊断用于囊胚期胚胎时，标本就不能很好地反映后天异质性。运用这种技术的变体——胚囊活组织检查产前筛查基因m3243A→G点突变时也出现了同样的问题(Treffetal.,2012)：滋养层细胞的突变程度（12%Treffetal.(2012)）大体上少于一些儿童标本（血液47%，尿液52%WallaceandChalkia(2013)andMitalipovetal.(2014)）。目前还未知这种异质性差异是发生在滋养层和内细胞团阶段之间，还是在妊娠期间改变的。这表明胚胎着床前的基因诊断也有一定风险。普遍来说，细胞间异质性和拷贝数变异出现于开始分化出具体功能的囊胚期细胞，可能因着床前胚胎mtDNA快速复制分裂而加剧(Leeetal.,2012)。这是一种普遍现象还是人工胚胎中两个融合的细胞质独立复制分裂的结果仍需进一步证明。如果是后者，这对于包括核移植在内的细胞质移植和其他技术都有重要意义(Steffannetal.,2014)。总之，胚胎分裂期进行着床前基因诊断意义较大，而在囊胚期则不可靠。新发展：mtDNA疾病的现代治疗方法上述改变mtDNA遗传性的技术存在几个弊端：首先，卵母细胞捐献技术导致后代不会遗传母亲的核DNA。其次，囊胚期着床前基因诊断和绒毛膜取样有一定风险，因为组织和单个细胞间的变异可以导