荧光光谱法测定水样中维生素B6的含量标准实验报告

F-4500荧光光谱仪测定水样中维生素B6的含量一、实验目的1.学习和掌握荧光光度分析法测定维生素B6的基本原理和方法。2.学习选择荧光激发和发射波长的方法。3.掌握F-4500荧光光谱仪的使用方法。二、方法原理1.分子荧光的产生物质在吸收入射光的过程中，光子的能量传递给了物质分子。分子被激发后，发生了电子从较低的能级到较高能级的跃迁。这一跃迁过程经历的时间约10-15s。跃迁所涉及的两个能级间的能量差，等于所吸收光子的能量。紫外、可见光区的光子能量较高，足以引起分子中的电子发生电子能级间的跃迁。处于这种激发状态的分子，称为电子激发态分子。电子激发态的多重态用2S+1表示，S为电子自旋角动量量子数的代数和，其数值为0或1。分子中同一轨道里所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。假如分子中的全部电子都是自旋配对的，即S=0，该分子偏处于单重态，用符号S表示。大多数有机物分子的基态是处于单重态的。倘若分子吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子处于激发的单重态；如果分子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋不配对的电子，即S=1，分子处于激发的是三重态（或称三线态），用符号T表示。符号S0、S1、S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发单重态，T1、T2分别表示第一和第二电子激发三重态。处于激发态的分子不稳定，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁的衰变过程而返回基态。辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射，即产生荧光或磷光；非辐射跃迁的衰变过程，包括振动弛豫、内转化和系间窜跃，这些衰变过程导致激发能转化为热能传递给介质。2.同一物质而言，荧光强度F与该物质的浓度C有以下关系:F=2.303YfI0bc，其中Yf为量子荧光产率，I0入射的光强度，是摩尔吸光系数，b是比色皿的厚度，C为所测物质的浓度。当0.05bc时，则荧光强度和溶液的浓度呈线性关系，即F=KC即在较低的浓度情况下，荧光强度与该物质的浓度C呈线性关系。三、仪器和药品F-4500荧光光谱仪、移液管、洗耳球、烧杯、天平、维生素B6、Na2HPO4、柠檬酸、蒸馏水等四、实验步骤1.标准系列溶液的配制100ug/mL维生素B6标准溶液：准确称取0.1g维生素B6溶解定容于100ml容量瓶。准确移取10ml该溶液稀释至100ml。在五个干净的50ml容量瓶中，依次移入0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml浓度为100ug/mL维生素B6标准溶液，并分别移入pH=7.0的缓冲溶液2.50ml，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。2.PH＝7.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲液取Na2HPO417.9g溶于烧杯后移入250ml容量瓶，稀释至刻度，摇匀，即成0.2mol/LNa2HPO4溶液。取柠檬酸2.1g溶于烧杯后，移入100ml容量瓶，稀释至刻度，摇匀，即成0.1mol/L柠檬酸溶液。将Na2HPO4与柠檬酸溶液按6:1的体积比配成缓冲溶液250ml。3.选择维生素B6荧光光谱4.F-4500荧光光谱仪的使用(1)开机①开启主机[power](在左下方)，确定散热风扇运转是否正常。②按[XeLamp]键(按下时间勿超过5秒)。检查XeLamp指示灯是否已亮，如每辆，需等10S后再按一次。③开启[MAIN]键,此时，RUN指示灯会闪一下。④开启计算机⑤开启软件即可开始操作。(2)软件操作步骤①点击桌面的，打开操作软件。②参数的设置：③将配制好的样品装入比色皿中，垂直放入样品槽中。将激发狭缝和发射狭缝分别设置为5nm和5nm，扫描速度设置为1200nm/min。用一号溶液，以em=390nm为发射波长，在260~360nm波长范围内扫描激发光谱，找出最大激发波长ex；以ex=326nm为激发波长，在350~450nm范围内扫描荧光光谱，找出最大发射波长em。4.标准溶液的测定设置适当的仪器参数（最大激发波长ex=326nm，最大发射波长em=390nm）测量标准系列溶液的荧光强度。5.未知试样的测定取未知液与标准工作曲线相同的条件，测量试样的荧光强度。五、数据记录及结果处理1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线如图。2.根据经稀释的待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度。六、思考题(3)什么是瑞利散射？瑞利散射如何消除？入射光在线度小于光波长的微粒上散射后散射光和入射光波长相同的现象。由英国物理学家瑞利提出而得名。1871年，瑞利在经过反复研究，反复计算的基础上，提出了著名的瑞利散射公式，当光线入射到不均匀的介质中，如乳状液、胶体溶液等，介质就因折射率不均匀而产生散射光。瑞利研究表明，即使均匀介质，由于介质中分子质点不停的热运动，破坏了分子间固定的位置关系，从而也产生一种分子散射，这就是瑞利散射。瑞利经过计算认为，分子散射光的强度与入射光的频率（或波长）有关，即四次幂的瑞利定律。(4)分子荧光的激发光谱和发射光谱为什么是镜像对称的？由荧光发射光谱和吸收光谱的成因来解释。吸收光谱中的第一吸收带(波长较长的吸收带)是由于基态分子吸收光能量被激发到第一电子激发态的各不同振动能级，所以，其形状取决于第一电子激发态中各振动能级的分布情况(即能量间隔情况)，而荧光光谱是激发态分子从第一电子激发单重态的最低振动能级跃回基态中的各不同振动能级所致，所以荧光光谱的形状取决于基态中各振动能级的分布情况。一般情况下，基态和第一电了激发单重态中振动能级的分布情况是相同的，所以荧光发射光谱与吸收光谱的形状是类似的。(5)荧光猝灭是什么原因造成的？荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂分子之间所发生的导致：荧光强度变化、相关的激发峰位变化、荧光峰位变化的物理或化学作用过程。与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度变化和相关的激发峰位和荧光峰位变化的物质被称为荧光猝灭剂（quencher）。荧光猝灭分为静态猝灭和动态猝灭。基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物，且该复合物使荧光完全猝灭的现象称为静态猝灭。激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。荧光分子本身浓度增大使其荧光猝灭的现象称为浓度猝灭或自猝灭。由于荧光的再吸收、荧光物质发生化学变化而观察不到荧光的现象一般不称为荧光猝灭。在利用荧光进行定量、液体闪击计数等包含荧光过程的测定方法中，一定要注意溶剂、共存杂质、氧气等猝灭剂的影响。