荧光分析在生物分析中的应用及最新进展

《现代光分析化学》课程论文题目：荧光分析法在生物分析中的应用及最新进展姓名：瞿超杰专业：药物分析学院系：化学与分子工程学院学号：2015121519421荧光分析法在生物分析中的应用及最新进展摘要：本文简述了荧光分析的机理；荧光分析的性质，主要包括生物相容性、高效荧光性能，着重探讨了荧光分析在生物领域的应用，如在DNA分析中的应用，在蛋白质分析中的应用，在肿瘤的检测和诊断中的应用。最后进一步指出了荧光分析在生物领域探索过程的一些问题，如有些修饰在荧光上的量子点水溶性不好等。同时展望了荧光分析在生物领域中今后的发展方向。关键词：荧光分析；生物；应用TheapplicationsandrecentadvancesoffluorescencespectrometryanalysisinbiologicalAbstract:Thepaperdescribesthemechanismoffluorescenceanalysis;includingfluorescenceproperties,biocompatibility,highefficiencyfluorescentproperties,focusedontheanalysisoffluorescenceinthefieldofbiologicalapplications,suchasusedinDNAanalysis,inproteinanalysis,intumordetectionanddiagnosis.Finally,pointedoutthefurtheroffluorescenceanalysistoexploresomeoftheissuesinthefieldofbiologicalprocesses,suchasthepoorwater-solubleofsomemodifiedfluorescentquantumdots.Meanwhileprospectthefuturedirectionofdevelopmentoffluorescenceanalysisinthebiologicalarea.Keywords:fluorescenceanalysis;biological;application21前言荧光分析法作为一种分析方法，早在19世纪60年代就已出现。该方法具有许多突出优点：①选择性好；②具有多种测定参数(如荧光寿命、荧光各向异性、荧光量子产率、荧光激发波长、发射波长等)；③灵敏度高；④具有多种检测技术和方法，故可以依据实际测定条件的不同加以选择，因而具有适用性强、选择性好、线性范围较宽的特点，是一种简便实用的分析技术[1]。生命科学的飞速发展对分析化学提出了大量新的课题，目前集中在多肽、蛋白质、核酸等生物大分子分析，生物药物分析，超痕量、超微量生物活性物质分析，甚至微生物分析等。荧光分析因其独特的性质—优良的光谱特性和光化学稳定性，而被广泛地应用于生命科学的许多领域。本文对荧光分析在生物领域中的应用研究进展进行了综述。2荧光分析法的原理荧光产生的原理是当紫外线照射到某些物质时，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的光，而当紫外线停止照射时，所发射的光也随之很快消失，这种光线被称为荧光。分子产生荧光的过程可由能级图来解释电子激发态的多重态用2S+l表示，假如分子中的全部电子都是自旋配对的，即S=O，该分子就处于单重态，倘若分子吸收能量以后电子跃迁过程中自旋方向不变化，这时分子处于激发的单重态，反之，则处于激发的三重态无论物质分子起初处于哪个电子激发态，它们均通过内转换以及振动驰豫返回至第一电子激发态的最低振动能级，当由第一电子激发态的最低振动能级跃迁至基态的各个不同振动能级时，则能量会以光辐射的形式将释放出来，即产生荧光[2]。3荧光分析的生物学性质从目前的研究成果来看，荧光分析具有非常好的生物相容性。荧光分析的毒性很低，在体内外的实验研究均有报道。将荧光碳点与细胞共孵育后，未发现对细胞产生改变[3]，在体内实验方面，通过小鼠存活率、表现症状、体质量变化、生化检测、病理学分析等多方面的评估，均未发现荧光碳点的任何毒性作用。Unfried等[4]就碳点对免疫功能的影响作了研究，发现碳点能够通过增加BALB/c鼠的CD+3分泌，减少CD+4/CD+8所占比例而减少Th1和Tc的反应；实验发现，在动物活体标记实验中，由于荧光碳点粒径小，可以及时地通过动物肾脏排出体外。荧光分析不仅稳定无闪烁不漂白而且具有更好的生3物相容性[5]。4荧光分析在生物领域的应用研究进展4.1在DNA分析中的应用4.1.1基于量子点荧光探针分析DNARussAlgar等[6]将量子点作为荧光供体，利用荧光共振能量转移原理设计了多色检测核酸杂交的方法表面修饰后的量子点可直接与核酸偶联制备成核酸荧光探针用于核酸分析中。Kim[7]等用氨基修饰的Cdse/CdS量子点作为荧光报告团与分子信标键合，灵敏地对核酸单碱基错配进行了检测，克服了有机荧光分子的一些缺陷。Li[8]等将表面修饰半肤氨酸的Zns量子点作为荧光标记物对核酸进行了定量测定。Tyagi和rammerl[9]于1996年设计了一种可以特异性识别核酸序列的新型荧光探针，通过与核酸靶分子进行杂交后发生构象的变化发出荧光。4.1.2基于金属络合物荧光标记物分析DNA稀土离子如Tb(lJI)和Eu(Ill)等金属离子具有谱带窄、发光寿命长、Stokes1[10]位移大、与生物分子结合能力强等特点可作为核酸发光探针标记物[11]。金属离子络合物探针包括三种类型：过渡金属离子络合物、稀土离子络合物及其它金属离子络合物。金属络合物荧光探针有EDTA与Tb(m)、Eu(III)的络合物和联吡啶、邻菲罗琳及其衍生物与钉、钻等金属离子的络合物等。Hasegaw[12]等综述了斓系元素化合物的分子设计和发光特性以及在生物分析中的应用研究。4.1.3复合型荧光纳米粒子分析DNA复合型纳米粒子是指荧光分子或发光分子通过其它材料的包裹或连接形成几百个甚至上千个发光粒子构成的纳米粒子，如包裹着若干个染料分子的荧光纳米球，包含着稀土配合物的纳米粒子。王柯敏等人[13]将CFS纳米粒子用DNA杂交检测，信号得到了有效的放大，显著地提升了检测的灵敏度。4.2荧光分析法在蛋白质分析中的应用4.2.1基于荧光纳米材料自身与蛋白质的相互作用进行检测蛋白质的痕量分析检测在食品、药物及临床分析中具有重要意义[14]。基于荧光纳米材料与蛋白质的相互作用，利用纳米材料的特殊荧光性质，实现对蛋白质的精确、快速痕量分析。CaiZhaoxia等[15,16]基于共振瑞利散射的原理，利用金纳米粒子和掺杂Cd的ZnSe量子点为探针实现了鸡蛋白中溶菌酶的超灵敏分析，检测限可达纳克级别。44.2.2基于荧光共振能量转移技术进行检测由于荧光共振能量转移技术具有光学分子尺的作用，故在蛋白质分析检测中具有更高的灵敏度。黄珊等[17]使用CdSe量子点，基于量子点与蛋白质之间的能量转移，建立了简单快速检测溶菌酶的新方法。该法在0.01～0.8μmol/L的范围内，荧光强度与溶菌酶浓度呈很好的线性关系，检测限为5.2nmol/L。4.2.3基于特异性免疫反应进行检测基于抗原抗体间的免疫反应，可以实现特定蛋白质的定量检测。XuBailu等[18]在2012年以葡萄糖为碳源制备出可溶于水的碳点，再分别用氨基修饰的凝血酶适体TBA15和TBA29修饰该碳点和SiO2纳米颗粒，凝血酶便可与这两者相互作用形成“碳点-凝血酶-SiO2纳米颗粒夹层结构，随着凝血酶浓度的增加，碳量子点的荧光强度增加，检测限为1nmol/L。林卉[19]提出了根据金纳米簇荧光猝灭机理，检测无标记木瓜蛋白酶检测方法。木瓜蛋白酶对包覆在BSA-金纳米簇表面的BSA的降解可引起BSA-金纳米簇的聚集，进而使BSA-金纳米簇的荧光发生猝灭。荧光强度的变化对木瓜蛋白酶的浓度有很好的响应，对木瓜蛋白酶的检测限为0.07μg/mL。4.3肿瘤的检测和诊断通过制备能与特殊分子结构和基团结合的量子点[20]，或将量子点与特异性的抗体键合，然后注入人体内，利用其专一性的结合和荧光特性，可以作为一种高效、稳定的新型荧光标记物应用于肿瘤的检测与诊断。Wu等[21]用巯基乙胺修饰的CdSe量子点对人肝癌细胞进行检测，通过观察其荧光图像及利用实时细胞电子传感系统对其追踪，发现CdSe很容易与细胞质膜结合进入癌细胞，并使癌细胞的新陈代谢速度明显减慢，为癌细胞的检测与治疗提供了新的方法。付志英等[22]用经羊抗小鼠免疫球蛋白(IgG)和聚乙二醇修饰的功能化的CdTe量子点荧光探针对胃癌细胞相关抗原进行了检测，与传统方法相比，不仅光稳定性得到很大提高,灵敏度也有所提高。黄宇华等[23]用ZnS量子点荧光探针对裸鼠舌鳞癌移植癌组织切片中bcl-2蛋白进行分析，检测结果定位准确、特异性强，为舌鳞癌的检测提供了新的依据。陈军等[24]研究CdTe量子点的浓度对口腔鳞癌细胞活性的影响发现，量子点浓度在20nmol·L-1时，在几小时至1~2d内，口腔鳞癌细胞的生长都没有受到影响。5展望荧光分析应用于生物分析不仅大大降低了分析成本、简化了分析手续，而且改善了5分析条件、拓宽了荧光分析的应用领域。今后的发展方向是：开发更多专属性的识别生物分子的化学试剂，探索并提出常规生物荧光分析新方法；与计算机技术紧密结合，研制出自动化程度高，获得和处理信息速度快的荧光分析仪器；发现和合成选择性优良的生物荧光试剂；与其他各种现代化的分析仪器和方法联合使用。以荧光分析技术为检测手段，建立了高效、灵敏的生物分子检测方法，为生物分析研究提供了新的思路和方法。使其有望将其应用于蛋白质组学、基因组学等研究领域的海量筛选。虽然目前荧光分析的应用中也存在不足，比如水溶性巯基修饰的量子点在水溶液中稳定性不好，影响荧光分析的拓宽应用。随着荧光分析技术的完善和发展，在不远的将来会对医学领域产生深远影响。参考文献[1]韩翠平.荧光碳量子点在生物医学领域的应用[J].科技展望,2015(19):222-223.[2]杨彬.荧光材料合成及其在金属离子检测中的应用[D].南京大学,2011:2-3.[3]ShiW,LiX,MaH,etal.Fluorescentcarbonnanodotsconjugatedwithfolicacidfordistinguishingfolate-receptor-positivecancercellsfromnormalcells[J].JournalofMaterialsChemistry,2012,22(25):12568-12573.[4]UnfrieK,AlbrechtC,KlotzLO,etal.CellularResponsestoNanoparticles:TargetStructuresandMechanisms[J].Nanotoxicology,2009,1(1):52-71.[5]WANG,Wei,CHENG,etal.Biologicalapplicationsofcarbondots[J].ScienceChinaChemistry,2014,57(4):522-539.[6]AlgarWR,KrullUJ.Towardsmulti-colourstrategiesforthedetectionofoligonucleotidehybridizationusingquantumdotsasenergydonorsinfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)[J].AnalyticaChimicaActa,2007,581(581):193-201.[7]JoongHyunKim,DimitriosMorikis,MihrimahOzkan.AdaptationofInorganicQuantumDotsforStableMolecularBeacons[J].SensorsandActuators