荧光物质的荧光特性及其定量分析

荧光物质的荧光特性及其定量分析指导老师：吴莹实验人：王壮同组实验：戈畅、陆潇实验时间：2016.5.30一．实验目的1．测量荧光物质的激发光谱和荧光光谱；2．掌握荧光物质的定量测定方法；3．熟悉F-2500（日立）荧光光谱仪结构及操作。二．实验原理（一）荧光的产生过程荧光是发射光。物质分子或原子在一定条件下吸收辐射能而被激发到较高电子能态后，在返回基态的过程中将以不同的方式释放能量。如在分子吸收分光光度法中，受激分子以热能的形式释放多余的能量，测量的是物质对辐射的吸收，属吸收光谱法；而发光分析是受激分子或原子以发射辐射的形式释放能量，测量的是物质分子或原子自身发射辐射的强度，属发射光谱法。激发光谱曲线：固定测量波长（选最大发射波长），化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。荧光（发射）光谱曲线：固定激发光波长（选最大激发波长），化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光，所以发射光谱的形状与激发波长无关。（二）荧光的产生与分子结构的关系1．跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；2．共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移；3．刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有；4．取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。（三）荧光分析荧光分析可应用于物质的定性及定量，由于物质结构不同，所吸收的紫外—可见光波长不同，所发射荧光波长也不同，利用这个性质可鉴别物质。在一定频率和一定强度的激发光照射下，荧光物质（稀溶液体系）所产生的荧光强度与浓度呈线性关系，可进行定量分析。（四）荧光光谱仪荧光光谱仪主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。三．仪器和试剂仪器：F-2500型荧光光谱仪（日立）。50mL容量瓶10个。试剂：罗丹明B储备液5μg/mL；荧光素储备液5μg/mL，罗丹明B未知溶液，荧光素未知溶液。四．实验内容1．标准溶液的配制：按要求分别配置罗丹明B和荧光素的系列标准溶液各4个。2.选取其中一个溶液，分别测绘罗丹明B和荧光素的激发光谱和荧光光谱，并找到它们各自的最佳激发波长Ex和最强发射波长Em。3．分别以罗丹明B和荧光素的最大激发波长Ex和发射波长Em测定标准溶液的荧光强度，在相同条件下测定未知样品的荧光强度。五．结果处理图1.罗丹明荧光发射光谱固定激发波长，扫描发射波长得到最佳发射波长为572.5Em图2.罗丹明荧光激发光谱再以572.5Em作为固定发射波长，扫描激发波长可以得到最佳激发波长553.5Ex在572.5Em、553.5Ex条件下分别测量4个不同浓度的标准样品，测量结果如下样品编号标样浓度（/gml）测量信号强度10.0230.2320.0457.8630.0682.6940.08117.9表1.不同浓度罗丹明B标准样品的测量结果作线性回归线如下图3.罗丹明标准工作曲线相关系数R=0.99447，测量未知罗丹明样品信号强度为70.42，带入工作曲线可以得到未知样品的浓度为0.048/gml。图4.荧光素发射光谱图测得荧光素的最佳发射波长为511.5Em图5.荧光素激发光谱图再以511.5Em作为固定发射波长，扫描激发波长可以得到最佳激发波长490Ex在511.5Em、490Ex条件下分别测量4个不同浓度的标准样品，测量结果如下样品编号标样浓度（/gml）测量信号强度10.014.60320.028.17730.0311.7940.0417.41表2.不同浓度荧光素标准样品的测量结果0.030.060.09050100150AC图6.荧光素标准工作曲线相关系数R=0.98616，测量未知罗丹明样品信号强度为6.969，带入工作曲线可以得到未知样品的浓度为0.017/gml六．思考题1.在测量荧光光谱曲线时如何区分荧光发射峰和激发光散射峰？答：荧光峰位置不随激发光源波长变化而变化,散射峰则不然。可以取一个稍不同的激发波长判断。2.为什么荧光光谱仪要配备2个单色器？为什么光源与检测器通常成直角？答：配备两个单色器是为了提高信噪比，测器处于一直线,光源发出的光可能直接进入检测器,造成很亮的背景,不利于待测物所发荧光的检测，所以光源与检测器要成直角。3.在发射波长相同但激发波长不同的情况下，测量得到的标准曲线斜率为什么相差很大？答：因为固定激发波长的信号强度随着发射波长的改变而改变，而激发波长的峰高直接影响了工作曲线的斜率。附：罗丹明B分子结构0.010.020.030.0461218AC