组培三大难题

（吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118）摘要：植物组织培养是以细胞全能性为理论基础建立的一种离体培养技术，阐述了植物组织培养快繁中褐变、玻璃化、污染和移栽成活率低等问题出现的原因，提出预防和控制措施。关键词：植物组织培养；污染；玻璃化；褐化中图分类号：Q813.1+2基金项目：1.吉林省自然科学基金项目（201215178）2.吉林省博士后科研项目启动经费资助[吉人社办字（2009）第100号]植物组织培养是利用植物体的一部分进行无性繁殖，而产生大量同源母本基因幼苗的生物技术。植物的组织培养到如今以和农业、园艺、林业、医药等多个方面有了密不可分的关系，为其提供了理论基础和研究方法。利用自然条件在获得珍稀植物和经济价值较高的植物时，由于受地域及季节的限制，很难达到高效、快速的目的。通过组织培养这一技术手段则能满足这一要求。组织培养在挽救珍惜植物、创造新物种等方面做出了重要的贡献[1]。但是在植物的组培技术上面临的三个难题却经常困扰大家。它们分别是污染，植物玻璃化和植物褐化。1污染污染是在组培过程中所面临的首要难题，该问题经常遇到并且难以解决。不能把污染率降低到可行的范围内植物组培就很难进行下去，这是该问题所要面对的第一个难题。在进行植物的组织培养时,通常存在两种污染方式：一种是外植体消毒不彻底以及无菌操作过程中引起的污染；另一种是引起内源菌污染的主要原因的真菌和细菌[2]。大多数的研究结果表明引起污染的主要原因为外植体的生长状况、环境条件和操作过程[3]。外植体污染是最难解决的污染之一。污染来源主要为外植体处理不当或培养基的灭菌不彻底，或对接种工具的消毒不够，或操作人员的操作不慎，或环境不洁等所致。选取外植体的原则是污染少易启动[4-5]。选择有最大分化潜能的外植体是确保组织培养成功的关键[6]。常规试验一般选用0.1%HgCl2溶液浸泡，再用无菌水对外植体进行反复冲洗，灭菌效果最好且污染率低。胡重怡等在烟草无菌苗培养前种子消毒技术的研究中使用先用70%C2H5OH溶液进行消毒，再用30%H2O2的浸泡，再用无菌水反复冲洗外植体，所得烟草种子污染率底[7]，H2O2分解后生成有杀菌作用的氧气而成为无毒害的化合物[8-9]对外植体的损害小。Morte等以1年生的山达脂柏幼苗的茎尖为外植体进行组织培养，采用以流水冲洗与30%NaClO溶液、10%H2O2,及80%C2H5OH消毒相结合的方法[10]。刘丽娟，李红梅等共用了6种不同方法对外植体进行消毒，从而发现使用0.1%HgCl2溶液浸泡，再用加上青霉素和链霉素混合液浸泡的方法是最适宜的，可用于生产实践。Mario等在对Juniperusnavicu-laris茎尖进行消毒处理时采用了漂白剂和杀真菌剂相结合的方法，污染率仅为1%[11]。由不能被一般的消毒方法所清除掉的外植体材料内部的微生物，随着材料带入到培养过程即为内源菌污染。通过以下措施也能降低由内源菌引起的污染，先对外植体植株进行预栽培管理，对外植体进行预处理，并改进消毒的方法（如真空减压法、酸化培养基、灼烧法等），为降低污染也可将培养基中的有机成分除去[12]。2植物组织玻璃化“试管苗玻璃化”是指植物组织培养的过程中，试管苗生长异常，丛生苗嫩绿透明、愈伤组织出现鲜绿水渍状，叶片整体皱缩纵向卷曲脆弱易碎，光合能力以及酶活性都有降低，继代培养和生根都极其困难，移栽后也不易成活[13]。迄今为止，玻璃化的形成尚无定论，目前普遍认为有以下几方面的原因。2.1组培材料差异组织培养时一般选取容易培养的材料作外植体[14]，所选取的远离培养基表面的幼小外植体易发生玻璃化。这可能是由于其在其生长环境的水分状况得以改善，或者是外殖体的较老组织中含有防止玻璃苗产生的物质。2.2培养基微环境的影响目前研究认为，产生玻璃化苗的因素主要有通风条件、温度、离子水平、光照时间等。如果封口处膜的通气性较差，瓶内外气体的交换会产生障碍，如麝香石竹就有生成玻璃苗的可能，随着温度升高，玻璃化率随之也会升高；光照时间过短或强度过低都会导致玻璃苗的出现。外植体在培养初期，特别是在诱导愈伤组织阶段，黑暗条件或弱光条件下培养效果更好，而在器官分化阶段，则需要较高强度的光照[15]。2.3矿质元素的影响培养基中的氨离子过多易导致试管苗玻璃化的发生，有学者认为B元素含量的增加，降低硝态氮或K、P、Fe、Cu、Mn、Zn等元素均可以导致玻璃化现象的产生。2.4琼脂已证实液体培养基基更容易使外植体产生玻璃化。琼脂浓度过高，会降低外植体的繁殖系数，使外植体生长缓慢。张燕玲等报道，培养基中的琼脂浓度与外植体玻璃化的发生概率呈极显著的负相关。Pochet等通过研究发现，在培养条件一致时，含SO4-2较多的琼脂对北美乔柏丛生芽诱导有益[16]。2.5植物激素在内源激素方面当外植体发生玻璃化时，外植体内源激素也在发生着显著的变化。乙烯（ETH）是否对植物组织玻璃化起作用学术界对此意见不一，Kevers和Gaspar报道在对石竹进行诱导玻璃化时产生大量ETH,，导致玻璃苗中ETH含量高于正常组织，但诱发组培苗玻璃化的原因却不是ETH的大量产生，这是因为诱导玻璃苗的产生与是否添加ETH前体ACC和是否提高培养容器中ETH水平无关[17]。此外，苹果的玻璃苗叶片和茎尖中细胞分裂素（CTK）含量显著上升，但是在茎叶极度玻璃化时，CTK含量就会明显的下降[18]。对赤霉素的敏感性石竹的玻璃苗要远高于高于正常苗[19]。从外源激素方面上来说，认为BA+NAA比KT+IBA更易使玻璃苗产生，且随着激素浓度的不断升高，外植体的玻璃化率也随之升高。这可能是由于NAA诱导了外植体细胞分裂素的驯化，因而导致了内源细胞分裂素较高而使玻璃苗产生。2.6糖的种类和浓度李云等在对珠美海棠进行离体培养时用葡萄糖（C6H12O6）来替换相同浓度的蔗糖（C12H22O11）玻璃苗发生率明显增加。认为MS培养基的糖浓度与玻璃苗发生率呈现极显著负相关。3褐化褐化是植物组织培养中一种常见的不利现象。褐化是指在对植物组织培养过程中在对外植体进行脱分化、再分化诱导时，通过外植体表面的自身组织向培养基中释放褐色物质，使培养基颜色逐渐加深最终变成褐色，外植体逐渐变褐直至死亡的现象[20]。目前大部分学者认为酶促反应是褐化的主要原因。褐化的发生是因为激活了组织中的多酚氧化酶，从而导致了酚类化合物被氧化成了醌类物质。在酪氨酸酶的作用下的醌类物质与蛋白质发生了聚合，引起外植体其他酶系统的失活，导致代谢紊乱，使植物的生长受到阻碍[21]。王颖，刘仁祥等在烟草愈伤组织培养褐化研究中加入抗褐化剂柠檬酸和PVP，PVP浓度是2g/L；柠檬酸浓度是8mg/L时较好地解决了烟草愈伤组织继代培养中的褐化问题[22]。姚永宏[23]等人在福鼎大白茶经升汞消毒后使用磁力搅拌充分清洗材料对外植体褐化有较大的效果。为使外植体可以正常发育在培养基中加入活性炭也可适当改变激素的比例，同时还可防止褐变[24-25]。4展望20世纪50年代在证实了植物细胞全能性存在的基础上，兴起的一门植物细胞工程技术。一门以植物生理学为基础发展起来的植物繁殖技术。经过了近一个世纪的发展，植物组织培养技术以其独特优势，在科学研究和生产上得以广泛应用。随着植物组织培养理论研究不断深入和相关设备的日益完善，该技术必将在更多的植物组培快繁中得到推广和应用，在植物工厂化、规模化生产中发挥更大的作用。参考文献[1]EricaEBenson.Plantconservationbiotechnology[M].London:Taylor＆Francis,1999.[2]周俊辉,周厚全,刘花全.植物组织培养中内生菌污染问题[J].广西植物,2003,23(1):41-47.[3]刘丽娟,李红梅,刘雪莲不同处理方法对外植体消毒效果比较研究[J].北方园艺,2009,(10):86-87.[4]陈正华.木本植物组织培养及其应用[M].高等教育出版社,1986.[5]王彭伟.肾蕨组培快速繁殖的研究.北京林业大学学报[J].1998,20(2):107.[6]BongaJM,KlimaszewskaKK,vonAderkasP.Recalcitranceinclonalpropagation，inparticularofconifers[J].PlantCell，TissueandOr-ganCulture,2010,100(3):241-254.[7]胡重怡,郑少清.在烟草无菌苗培养前种子消毒技术的研究.贵州烟草科学研究,2007,02-0045-02.[8]李云.林果花菜组织培养快速育苗技术[M].北京：中国林业出版社,2001.[9]王利民,周毅,陈龙友,等.植物组织培养中消毒剂的运用[J].贵州师范大学学报,2002,20(1):15-17.[10]MorteMA,HonrubiaM,PiquerasA.MicropropagationofTetraclinisarticulate(Vahl)Masters(Cupressaceae)[J].PlantCell,TissueandOrganCulture,1992,28(2):231-233.[11]MarioRuiCastro,AnabelaFerreiraBelo，AnabelaAfonso,etal.Mi-cropropagationofJuniperusnavicularis,anendemicandrarespeciesfromPortugalSWcoast[J].PlantGrowthRegulation,2011,65(2):223-230.[12]邓小梅.植物组织培养过程中污染现象的研究进展[J].北方园艺,2006(6):68-72.[13]刘淑玉,祁东文,冯文伟.如何克服组织培养中试管苗玻璃化问题[J].新疆林业,2001(1):15.[14]李浚明.植物组织培养教程[M].北京:中国农业大学出版社,2002:11.[15]李翠娟.灯台组（PrimulaSect.Proliferae）报春花栽培与杂交育种研究[D].北京:北京林业大学硕士论文,2007.[16]PochetB,ScomanV,MestdaghMM,etal.Influenceofagargelprop-ertiesontheinvitromicropropagationofdifferentclonesofThujapli-cata[J].PlantCellReports,1991,10(8):406-409.[17]KeversC,GasparT.Solublemembraneandwallperoxidases,phenyl-alanineammonialyaseandligninchangsinrelationtovitrificationofcarnationtissuescultredinvitro[J].JPlantPhysio,l1985,118,41-48.[18]牛自勉,王贤萍,戴桂林.苹果砧木玻璃化过程中内源激素的含量变化[J].华北农学报,1995,10(3):15-19.[19]BottcherI,ZoglauerK,GoringH.Inductionandreversionofvitrifica-tionofplantsculturedinvitro[J].PhysiolPlant,1988,72:550-554.[20]高国训.植物组织培养中的褐变问题[J].植物生理学通讯,1999,35(6):501-506.[21]曾镭.刘燕植物组织培养中褐化问题的研究进展[J].安徽农学通报,2007,13(14):49-50.[22]王颖,刘仁祥.不同防褐剂对烟草愈伤组织培养褐化现象的抑制效应[J].贵州农业科学,2012,40(1):26-27.[23]姚永宏,周正科,侯渝嘉,等.福鼎大白茶外植体选择及愈伤组织诱导条件初探[J].现代农业科学,2009,16(4):37-38．[24]陈惠娟.植物组织培养中褐变的产生机