纳米氧化铈放疗增敏及对正常细胞保护作用

1、细胞细胞对GNPs的摄取(1)取处于对数生长期的A549细胞，接种于25cm2的培养瓶中;(2)待细胞生长至70%-80%时，弃去培养液，更换为浓度均为5nM的GNPs培养液，继续培养细胞;(3)药物处理后分别于6,12,24,48h后收集细胞于15m1离心管中。在胰蛋白酶消化细胞前，弃去旧的培养液，PBS冲洗细胞2次，去除培养液中未被细胞吸收的游离的纳米颗粒。收集细胞悬液，计数细胞总量N}，加入PBS至5ml;(4)加入5ml20%HNO3溶液，混合均匀，室温下静置48h充分裂解细胞;(5)ICP-AES测定裂解液中金原子的质量浓度，按方法计算纳米颗粒的摩尔浓度及纳米颗粒的总数量NGNPs。因此每个A549细胞内的纳米颗粒的量n=NGNPs}Nc;(6)实验重复至少3次。2.GNPs在细胞内的分布(1)取处于对数生长期的细胞，接种于25cm2的培养瓶中;(2)待细胞生长至70%-80%时，弃去培养液，更换为含有浓度为5nM的GNPs的培养液，继续培养细胞;(3)24h后弃去培养液，PBS冲洗2次，胰蛋白酶消化后离心收集细胞;(4)电镜标本制作步骤:①固定:在离心所得的细胞团块中加入2.5%戊二醛2m1固定至少4h;②漂洗:固定后PBS漂洗2次;③脱水:细胞团块脱水按梯度进行，依次为70%丙酮15分钟，80%丙酮15分钟，90%丙酮15分钟，100%丙酮1o分钟(2次);④浸透和包埋:将样本用环氧树脂包埋，然后置烤箱烘干，在450C(12小时)、600C(36小时)烤箱内加温，即可聚合硬化，形成包埋块;⑤超薄切片:将包埋好的蜡块熔粘在特制的木块上，然后固定在旋转切片机上进行一切片;⑥载网:将切片置于直径为3mm的圆形铜网上;⑦染色:预先取一个清洁的培养皿，将石蜡溶解制作成蜡板，然后滴数滴染液于蜡板上用摄子夹住载网的边缘，把贴有切片的一面朝下，使载网浮在液滴上，盖上培养皿，染色10-20分钟。载网从染液中取出后，尽快用蒸馏水清洗干净;(5)电镜观察、拍片及记录:做好观察记录，选好范围拍片，准确记录底片号码及相应内容，然后在电脑中备案。3.MTT实验检测GNPs对A549细胞的毒性作用(I)取处于对数生长期的A549细胞，以5000/孔的密度接种于9G孔板中;(2)培养过夜，待细胞贴壁生长后，弃旧培养液，加入小同浓度梯度(0nM,5nM,l0nM,20nM)的GNPs培养液;(3)培养24h后，弃培养液，PBS冲洗2次，以去除培养液中游离GNPs,加入新鲜培养液继续培养;(4)MTT实验检测不同时间梯度(24h,48h,72h)细胞的存活分数;MTT的实验步骤:①每孔培养液加入20ulMTT溶液((5mg/mI),继续培养4h;②止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ulDMSO,放置摇床低速振荡l0min，使结晶物充分溶解;③酶联兔疫检测仪检测490/560nm处各孔的吸光度值;④下列公式计算各孔细胞的存活率:细胞存活率二(实验组OD值一空白对照组OD值)/(对照组OD值一空白对照组OD值)XI00%⑤组细胞至少重复3次。4.MTT实验检测GNPs对细胞的放疗增敏效应及对正常细胞保护(1)实验分4组:①对照组，②药物(GNPs)组，③照射(IR)组，④联合组(GNPs+IR);(2)取处于对数生长期的细胞，以5000/孔的密度接种于96孔板中;(3)培养过夜，待细胞贴壁生长后，弃旧培养液，加入不同浓度梯度0nM,5nM,I0nM,20nM)的GNPs培养液;(3)培养24h后，弃培养液，PBS冲洗2次，以去除培养液中游离的GNPs，加入新鲜培养液继续培养;(4)③组和④组行X线照射，剂量为l0Gy(6MVX-ray，SSD100cm，加2cm等效物);(5)培养24小时后用MTT法检测各孔细胞的存活率。实验原理及步骤同上。5.细胞克隆形成实验(1)实验分4组:①对照组，②药物(GNPs)组，③照射(IR)组，④联合组(GNPs+IR)，其中③、④组按不同照射剂量分为不同的亚组;(2)将对数生长期的细胞，台盼蓝染色活细胞计数(活细胞比例须90%);(3)设定照射剂量分别为0Gy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy及10Gy，依照剂量梯度将不同数量的细胞接种于6孔板中(分别为50,200,400,1000,2000,5000);(4)培养过夜，待细胞贴壁生长后，弃旧培养液，②、④组加入浓度为20nMGNPs培养液，继续培养;(5)24h后弃培养液，用PBS冲洗2次，各组均加入新鲜的培养液;(6)③、④组中各亚组按不同剂量梯度进行照射;(7)处理结束后将细胞置于培养箱中继续培养10-14天，注意定期更换培养液;(8)当6孔板中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃培养液，PBS洗涤2次，加入纯甲醇固定15分钟。弃固定液，加Gimsa染液染色20分钟，洗去染色液，干燥;(9)镜下观察并计数50个细胞的克隆数;(10)按下列公式计算存活分数，绘制细胞存活曲线:克隆接种率(platinget}iciency,PE)=(对照组克隆数/接种细胞数)X100%;存活分数(survivingfraction，SF)=实验组克隆数/(接种细胞胞数XPE):6.流氏技术检测细胞周期的分布(1)实验分4组:①对照组，②药物(GNPs)组，③照射(IR)组，④联合组(GNPs+IR)(2)取对数生长期的A549细胞，以2X10^5/孔的密度接种于6孔板中;(3)培养过夜，待细胞贴壁生长后，弃旧培养液，②、④组加入浓度为20nM的-GNPs的培养液;(4)培养24h后弃培养液，PBS冲洗2次，加入新鲜培养液，③、④组给予照射剂量l0Gy;(5)处理结束后继续培养24小时，然后收集细胞;(6)用冰浴预冷PBS洗涤细胞两遍，1,000rpm离心5min，弃上清，缓慢加入lml冰浴预冷的70%乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定过夜，1,000rpm离心5min，弃上清，收集固定细胞，用PBS洗涤细胞，1,000rpm离心5min，弃上清，每管细胞加入0.5m1碘化丙叮染色液，缓慢充分重悬细胞，37℃避光温浴30min，立即放入冰浴中，再加入100mg/1PI溶液800u1,40C避光放置30min，采用型流式细胞仪分析细胞周期。实验重复3次。7.流氏技术检测细胞凋亡(1)实验分4组:①对照组，②药物(GNPs)组，③照射(IR)组，④联合组(GNPs+IR);(2)取对数生长期的细胞，以2X10^5/孔的密度接种于6孔板中;(3)培养过夜，待细胞贴壁生长后，弃旧培养液，②、④组加入浓度为20nM的GNPs的培养液;(4)培养24h后弃培养液，PBS冲洗2次，加入新鲜培养液，③、④组给予照射剂量I0Gy;(5)处理结束后继续培养24小时，然后收集细胞;(6)用冷PBS洗涤细胞两次，2000rpm离心Smin，收集细胞;(7)用400p1AnnexinV结合恳浮细胞，细胞浓度大约为1XI0^6/ml;(8)}在细胞恳液中加入5ulAnnexinV-FITC染色液，轻轻混匀后4C避光条件下孵育15分钟;(9)加入10ulPI染色液后轻轻混匀后轻轻混匀后4C避光条件下孵育5分钟(10)在1小时内用流氏细胞仪检测，每份标木累计分析10000个细胞;8．细胞内活性氧自由基测定细胞内活性氧自由基(ROS测定需要一种荧光探针一CM-H2-DCFH-DA,其原理为入细胞内:CM-H2-DCFH-DA本身没有荧光，可以通过扩散作用透过细胞膜进并在细胞内酶的水解作用下脱去乙酞基团，形成的DCFH过细胞膜从而保留在细胞内。细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH,不能透。生成有荧光的DCF。因此，如果细胞内存在ROS，可通过检测DCF的荧光强弱直接反映出细胞内ROS的水平。实验过程如下:准备边长为12~的盖玻片，冲洗干净且高压消毒，备用。6孔板的每个孔中加入一个盖玻片，将细胞接种于此孔，过夜，制备细胞爬片。将细胞随机分四组①对照组，②GNPs组，③X一线照射组，GNPs+X-线照射组。去掉旧培养液，①组和③组更换含10%FBS的新鲜培养液;②组和④组更换含有终浓度为5nM的GNPs的无血清培养液。继续培养24小时。③组和④组分别采用90kvp和6MVX一射线发射机照射，剂量为8Gy。照射完毕后，更换含10%胎牛血清的培养液继续培养24小时。按照活性氧检测试剂盒说明书步骤操作，吸掉各孔培养液并用PBS溶液冲洗2次，加入含DCFH-DAC10}M)的缓冲液，覆盖住盖玻片即可，370C孵育20分钟。吸掉缓冲液，PBS溶液冲洗3次，将盖玻片转移至载玻片上，并滴入抗荧光淬灭剂，制片完成。