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细胞活体染色技术于鹏远生物技术2实验目的•学习细胞活体染色的方法。•观察动、植物活细胞内线粒体,液泡系的形态、数量与分布。3细胞膜结构4实验原理一般的生物材料不能穿透细胞膜,只有当细胞被固定后,细胞膜被破坏,染料才能进入细胞内部。但是,有一些染料(称“活体染料”)却能进入活细胞,它们是一些无毒或毒性很小的染色剂,能使细胞中某些特定结构着色。活体染料基本上不影响或很少影响细胞的生命活动。5•活染法弥补了活观察法不能显示细胞精细结构的不足,也避免了固定染色法对细胞结构的破环和造成人为假象的弊病。遗憾的是,适宜活体染色的染料较少,能显示出的结构和种类也不多。•活体染色分为体内活染和体外活染两种。前者是将染料注射于生物体内,染色后再取材观察。后者是取材后,对离体的活细胞进行染色。为保持离体细胞的正常存活,染色时需供给细胞以正常的温度,渗透压,PH等。6活体染色7较为常见的活体染色剂•詹纳斯绿B(JanusgreenB)•中性红•台盼蓝(trypanblue)8詹纳斯绿B(JanusgreenB)•专一用于线粒体的染色。它可以和线粒体中的细胞色素C氧化酶结合,保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态。•必须指出的是,只有具有活性的细胞色素C氧化酶才能够把詹纳斯绿B氧化,从而使它显出颜色9人口腔上皮细胞的线粒体分布•在实验过程中务必保持所取的材料的活性。通常,需要把生物材料置于0℃~4℃的冰水浴低温中,并且操作要迅速。1011中性红•中性红是液泡系的特殊活体染色剂,它可将不同发育时期的液泡染成不同深度的红色,在细胞处于生活状态下细胞质和核不被染色,该染料对液泡系具有一定专一性。1213液泡系的中性红染色点经观察14台盼蓝(trypanblue)•台盼蓝:正常的活细胞,胞膜结构完整,能够排斥台盼蓝,使之不能够进入胞内;而丧失活性或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色。•通常认为细胞膜完整性丧失,即可认为细胞已经死亡,这与中性红作用相反。因此,借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。台盼蓝是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染色方法之一。注意凋亡小体也有台盼蓝拒染现象。1516实验用品材料:黄豆根尖、洋葱、小鼠。器械:显微镜、镊子、刀片、’剪刀、解剖针、表面皿、载玻片、盖玻片、吸管、收水纸等。试剂:Ringer氏液1/3000中性红溶液1/5000詹纳斯绿B台盼蓝染色液香柏油、二甲苯、蒸馏水等17实验方法1.液泡系的中性红活体染色取黄豆芽的根尖处的纵切面↓于载玻片上的中性红染液中染色5─10min↓吸去染液,滴一滴Ringer液↓盖上盖玻片进行镜检182.线粒体的活体染色⑴用植物细胞观察线粒体的活体染色撕取洋葱鳞茎内表皮一小块↓于载玻片上的1/5000JanusgreenB染色30min↓吸去染液,滴一滴Ringer液↓盖上盖玻片进行镜检19娶取鼠肝肝组织一小块,放入盛有Ringer氏液表面皿中洗去血液↓于载玻片上的1/5000JanusgreenB染色30min↓撕开组织块,这样溶液中会有一些细胞或细胞群↓吸取溶液,放在载玻片的Ringer氏液中↓垫上两根短头发,盖上盖玻片进行镜检⑵用动物细胞观察线粒体的活体染色为什么要用油镜观察,植物细胞却不用?为什么要垫上两根短头发?思考203.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上↓滴2滴1/5000JanusgreenB染液↓用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞↓刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中↓染色10~l5min(注意不可使染液干燥,必要时可再加滴染液)↓盖上盖玻片,显微镜下观察214.台盼蓝染色鉴定细胞死活取小鼠腹腔水细胞于洁净载玻片上↓滴加1%台盼蓝1滴↓盖上盖玻片于显微镜下进行镜检22注意事项•对口腔上皮细胞进行染色时不可使染剂干燥,可适当补加染液。•在对植物进行观察时一定要让材料尽量展开。•詹纳斯绿B(JanusgreenB)溶液现用现配,以保持它的充分氧化能力。•试验中速度要快,以免组织细胞死亡23思考题•所观察到的液泡大小是否有差别,染色深度是否一样,并绘图加以说明。•所观察到线粒体分布在细胞何处.呈什么颜色,其形状如何,绘图加以说明。•比较线粒体在动、植物中的分布、颜色,其形状如何?24thanks
本文标题:细胞活体染色技术.
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