细胞生物2013含泪吐血整理

单革考题：1，生命化学起源与生命进化有哪些重要阶段（写出不少于五个，按时间先后顺序），以一个重要阶段为例，说明此阶段对地球环境及生命起源进化本身的影响（5分）答：生命化学起源和生命进化重要阶段：a．非生物合成小的有机分子（单体）（C+H=有机分子）。b．单体聚合形成聚合物（蛋白质、核酸）。c．合成能自我复制的分子（遗传性状）-----蛋白质和核酸D.有机分子组装成原生生物-----非生物分子维持内部化学环境的平衡并展现某些生命特征。遗传起源（originsofheredity）：出现最早的遗传物质，可能为RNA；原始细胞出现（proto-cells）：有活性的物质开始有膜包裹；最早的细胞出现；出现光合作用；出现有氧呼吸形式；出现捕食行为；真核生物出现；多细胞生物出现；(2)光合作用：循环光合作用途径起源于35-32亿年前，阳光作为能源被生物利用。非循环光合作用途径出现在25亿年前，不仅可以利用光能，而且可以放出O2。自此之后，空气中的O2开始聚集。为有氧呼吸的出现提供了条件。有氧呼吸可以为生物活动提供更多能量，对生物进化意义重大。2，你在研究中发现一个新的哺乳动物细胞中的RNA分子，设计实验证明它是mRNA还是非编码RNA，如果证实其为非编码RNA，设计实验研究其功能（10分）答：(1)验证是mRNA还是ncRNA：真核生物中的mRNA有明显的特征序列，即5’帽（m7G）和3’Poly（A）尾巴。而哺乳动物mRNA的3’端有20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，可以作为鉴别mRNA的标志。具体方法：首先合成15-20的聚dT和聚dA——先进行聚dT的单引物PCR，经过5-10个循环——加入聚dA继续进行PCR，经过25个循环——结束后，进行电泳。如果得到了相应的扩增条带，说明此核苷酸序列是mRNA；反之，则为非编码RNA。测序。。。无细胞表达系统(2)研究非编码RNA的功能：（假设用于研究的模式生物为小鼠）首先，根据得到的ncRNA的序列，利用生物信息学的方法，把它在基因组上定位——定位之后，对培养的细胞进行基因敲除实验，使表达此ncRNA的DNA失去此功能——进行细胞培养，观察此基因的确实会对细胞的生长造成怎样的影响，从而确定这一ncRNA的功能。后续研究可以在胚胎细胞中进行基因敲除，观察对动物生长发育过程有何影响。假如该RNA为ncRNA。研究功能的实验设计如下：（1）敲除该RNA的gene，观察细胞与正常细胞的差别。（2）过量表达该RNA，观察细胞与正常细胞的差别。（3）RNAi。（4）检测与RNA相互作用的DNA、RNA或蛋白质进行下游分析。（5）生物信息学方法分析功能与通路。3、基因转录调控和染色质状态调控之间是如何协调进行的，分别以转录抑制和转录激活为前提进行详细叙述（10分）答：要想起始基因转录，需要染色质解螺旋化，即从紧密状态变为松散状态。这样，RNA聚合酶才能够结合，进而起始转录过程，这时染色质可以说处于活化状态。反之，若染色质高度螺旋化，便不能进行转录过程，这时染色质则处于失活状态，如巴氏小体即是处于此状态。会有DNA结合蛋白与DNA结合，调控其表达。ARE基因：色氨酸阻遏子蛋白的结合改变其构象。组蛋白在基因表达调控中起到重要作用。H2A在基因激活和抑制中都起到重要作用。(1)转录抑制过程：转录抑制过程包括多个方面，例如抑制转录激活因子和DNA的结合、抑制RNA聚合酶活性、组蛋白修饰以及染色质结构改变等等。其中，当染色质结构改变，即从低螺旋化状态转变为高度螺旋化时，便不能进行mRNA的合成，转录即被抑制。调节染色质结构改变的因素有：组蛋白的去乙酰化（去乙酰化后利于高螺旋状态的形成）、染色体结合蛋白的作用、CpG中胞嘧啶的甲基化作用等。(2)转录激活过程：基因激活蛋白结合到染色质上，形成染色质重构复合体——染色质发生重构，组蛋白修饰酶加入——组蛋白发生共价修饰，附加的激活蛋白结合到基因的调控区上，之后加入mediator(介导物)、一般的转录因子以及RNA聚合酶——在启动子处发生前起始复合体的聚合，之后加入其他的基因激活蛋白，再之后向前起始复合体中加入重排蛋白——起始转录，在复合物形成的过程中往往会使DNA形成loop结构。转录激活过程中组蛋白的变化：富含Lys组蛋白水平降低；H2A、H2B二聚体不稳定性增加；组蛋白发生修饰；H3组蛋白巯基暴露。DNA的甲基化和组蛋白的修饰会是基因组的不同区域显示出不同的转录潜能，常染色体质通常高组蛋白乙酰化，低DNA甲基化和H3-K4甲基化，异染色质有低组蛋白乙酰化，高DNA甲基化和H3-K9甲基化。被折叠的染色质形成loop结构，具有较高的转录活性，形成RNA酶复合体。染色质对基因转录抑制包括改变染色质-DNA的联系和内部染色质的联系,这些变化是通过组蛋白的修饰完成的.组蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因活化和抑制过程中的主要调控机制,组蛋白去乙酰化会导致形成阻遏性染色体复合物以至全染色体灭活.组蛋白修饰酶主要有组蛋白乙酰基转移酶,组蛋白去乙酰基转移酶,组蛋白转甲基酶和组蛋白激酶.它们通过核心组蛋白乙酰化调节核小体结构及其相关基因的转录活性.核小体核心组蛋白(H3/H4)碱基N端的多个赖氨酸残基是可逆乙酰化参与调节基因转录的靶位点。在哺乳动物体细胞中,组织特异性基因中的CpG二核苷酸在无转录活性时常含有甲基化的胞嘧啶碱基;而有转录活性时则多含有未甲基化的胞嘧啶碱基.甲基化通过过甲基-CpG结合蛋白或特异性转录激活因子的阻遏作用而实现转录抑制。4、从microRNA和RNAi通路的发现中你得到哪些启示（至少列举三点或详述一点）（5分）答：microRNAandRNAinterference(RNAi)（1）合适模式动物的选择非常重要RNAi是在研究秀丽隐杆线虫（C.elegans）反义RNA（antisenseRNA）的过程中发现的。秀丽隐杆线虫有五对体染色体和一对性染色体，多数雌雄同体，只有极少数为雄性。成虫约长１毫米，生命周期大约为三天半，他们以大肠杆菌为食，易于大量培养，每只成虫在生命周期里可产生约３００只后代，适合作遗传学研究。此外，培养秀丽隐杆线虫成本低，在实验室中容易掌控，并且可以在不用时冷冻，解冻之后仍能存活，因此适合长时间储存。此外，秀丽隐杆线虫身体透明，在研究细胞分化及其他发育过程方面特别有贡献。每个体细胞如何发育都有详细的纪录，其细胞发育的命运在个体之间差异不大。秀丽隐杆线虫也是第一个基因体完全被定序的多细胞生物。（2）不轻易放过任何一个实验中遇到的不正常的结果，可能新的发现就是在这些结果中诞生注射正义RNA（senseRNA）和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽隐杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释，正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，并将这一现象命名为RNAi（3）敢于接受新的事物，新的思想（4）当一个新的现象被发现后，其作用机制要经过一段较长时间、很多人的研究才能逐步明朗。说明生物学科的发展不是单个人、单个实验室的研究就可以完成的。5、简述雌性哺乳动物体细胞X染色体随机失活的过程。（5分）X染色体失活包括一系列相关的过程:启动、传播和维持。X失活于囊胚期末开始建立。X染色体失活始于X染色体上的特异性失活位点XIC基因座的启动，朝两个方向扩展。在XIC内存在基因XIST（X染色体失活特异转录物）。当使一条X染色体失活时，有一专一表达的独特形式，而一条有活性的X染色体没被表达。XIST的表达产物是一顺式作用的核RNA，而不编码生成蛋白质。XistRNA顺式包裹表达它的染色体并引发快速基因沉默，导致表达Xist的X染色体上的大多数基因的活性被抑制，成为失活的X染色体。而表达它的翻译转录产物Tsix的染色体保留了活性。失活过程：Xist是一条16000nt的长ncRNA，形成XistncRNArecuitedcomplex后，通过X染色体上的进入位点结合到染色体上。之后，复合体可以募集一种特定的组蛋白H2A1.2，使染色体保持在失活状态。此外，Xist还可以募集组蛋白去乙酰化酶和甲基化酶的复合体。Xist的活性由另外一个4000nt的长ncRNA——Tsix调控，包含一个Xist的反义链，可以通过与Xist互补配对来调节其活性。6、简述研究基因表达调控和表观遗传调控的数种方法（举出八种方法名称；或者写出三种方法，并对每种给出简述）。（5分）？？？①凝胶缓滞实验②核染色体免疫沉淀③DNA亲和层析④DNAfootprintingDNA亲和层析：第一步：把细胞内所有蛋白加入层析柱中，里面有含有很多不同DNA序列的基质。之后用低盐溶液洗去未结合DNA的蛋白，再用中盐溶液把结合了DNA的蛋白洗提出来。第二步：把第一步中的DNA结合蛋白加入只含有GGGCCC/CCCGGG序列的层析柱中，之后用中盐溶液把所有对此序列不特异的蛋白都洗去，再用高盐溶液洗提特异性识别GGGCCC/CCCGGG的蛋白。基因表达调控：a.基因敲除：用同源序列替换目的基因达到目的基因失活的作用观察该基因作用与表达产物。b.基因芯片：高通量筛选和检测基因的表达状况。c.报告基因：研究基因的表达过程以及其启动子增强子的作用途径。D.凝胶迁移电泳E.DNAfootprinting表观遗传学：a.甲基化特异性寡聚核苷酸生物芯片实验b.实时RT-PCR实验对DNA甲基转移酶mRNA的相对定量分析c.基因沉默研究表型非编码RNA：a.全基因组tiling芯片技术（基因芯片）b.原位杂交：研究ncRNA不同时段所处位置所起作用等。c.RNAi研究相应ncRNA的功能7、简述RNAworldhypothesis的主要内容,简要讨论目前已知的RNA在生命活动中的哪些功能支持了RNAworldhypothesis.（5分）在DNA作为遗传物质以前，在原始的生命中，RNA既是可自我复制和进化的遗传物质，同时也是可催化代谢活动的酶。之后，RNA作为遗传物质的功能被更稳定的DNA所取代，催化功能被蛋白质取代。遗传信息通常存储为DNA，但一些生物如病毒使用RNA来存储信息。rRNA作为mRNA的支架，使mRNA分子在其上展开，实现蛋白质的合成。核酶的化学本质是核糖核酸(RNA),却具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子,有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。核酶的功能很多,有的能够切割RNA,有的能够切割DNA,有些还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。白丽考题：1，现发现外源分子e能激活细胞A释放分子f并导致细胞B的活化，已知细胞A与细胞B在特定条件下可以发生直接相互作用，并且细胞B表达f分子的受体。请问在外源分子e的作用下致使B细胞活化的可能性有哪几种，如何通过实验验证答：(1)可能性：a、外源分子e与细胞A上的受体结合使之激活并释放分子f，而分子f与细胞B表面的受体结合导致细胞B活化。b、外源分子e与细胞A上的受体结合使之激活，之后细胞A与细胞B发生直接相互作用，使得细胞B活化。c、外援分子e直接与细胞B上的受体结合，使细胞B活化。(2)实验验证：将细胞溶液离心，取上清液处理新鲜的B细胞；细胞沉淀物使用去垢剂处理，同样去刺激新鲜的B细胞。若前者能使B细胞活化，则表明该细胞的活化是由于胞外小分子的作用；若是后者能使细胞活化，则为细胞接触依赖的信号转导。2、简述SH2、SH3、PH结构域的功能和生物学意义。含SH2结构域的蛋白可以特异性识别多肽序列中的磷酸酪氨酸残基，SH3可以识别富含脯氨酸的序列；这两种结构域能作为接头蛋白上的结构域行使信息传递的功能，但其本身没有催化活性。PH结构域可以识别磷脂酰肌醇。这些结构域通过介导蛋白与蛋白或蛋白与脂质间的相互联结作用调节信号转导蛋白在细胞内的定位，依靠高度保守的小的相互作用结构域。从而特异地决定信号转导的途径。这些结构域所介导的信号传递过程在细胞增殖、分化甚至凋亡中起着重要作用。1，提高了效率，减少了信号分子扩散消耗的时间2，另外还有就是阻止了