细胞生物学作业

2015年秋季学期细胞生物学第二次作业系别：专业：姓名：学号：—2015.12.17—1一、细胞周期蛋白有什么特点？举例说明它们在细胞周期中是如何发挥作用的。细胞周期蛋白是1983年在T.Hunt实验室研究海胆细胞周期调控时最先被发现的。它们在细胞中的含量随着细胞周期的进程而变化：在细胞间期内积累，在细胞分裂期消失，在下一个细胞分裂周期中又重复；因此被命名为细胞周期蛋白（cyclin)。这些周期蛋白在细胞周期中表达的时期不同，浓度在细胞周期中呈周期性变化，随着细胞周期阶段的不同，浓度差异很大。并且它们执行的功能各异。但是各种周期蛋白之间有共同的结构特点，它们均含一段约100个氨基酸残基的保守序列，称为周期蛋白框（cyclinbox）。周期蛋白框介导周期蛋白与周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）结合，不同的周期蛋白框识别不同的CDK，组成不同的周期蛋白-CDK复合体，表现不同的CDK激酶活性。M期周期蛋白分子的近N端含有一段9个氨基酸组成的特殊序列，称为破坏框（destructionbox），参与泛素介导的周期蛋白A和B的降解。G1期周期蛋白分子的C端含有一段特殊的PEST序列，可能与G1期周期蛋白的更新有关。细胞周期蛋白必须与周期蛋白依赖性的蛋白激酶结合并将之激活。不同的周期蛋白激酶与特定的一种或几种周期蛋白结合，在细胞周期中执行不同的调节功能。对细胞周期中某一特定事件的调节，也可能不止一种周期蛋白激酶的参与。尽管各种CDK执行的功能有所区别，但它们的分子都含有一段类似的CDK激酶结构域（CDKkinasedomain），其中一段PSTAIRE的序列相当保守，可能与周期蛋白的结合有关。CDK蛋白的效应是多方面的，如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将H1蛋白磷酸化导致染色体的凝集等。细胞周期调控示例：（1）酿酒酵母细胞的周期调控。酿酒酵母只有一种细胞周期蛋白激酶，CDK1。在细胞周期中，结合不同的周期蛋白而表现不同的激酶活性，调控细胞周期的不同阶段。（2）哺乳类细胞的周期调控。哺乳动物细胞中有6种CDK激酶，5种周期蛋白。不同的CDK与各自的周期蛋白结合，在细胞周期的不同阶段发挥作用。2二、细胞周期中都有哪些检验点？它们是如何对细胞周期的运行起监控作用的。细胞周期的运行是一个非常有序额过程。这个过程是在一系列被称为检验点（checkpoint）的严格检控下进行的。细胞周期检验点也称细胞周期检控点，或细胞周期控制点。当DNA发生损伤、DNA复制不完全、蛋白质合成和积累不足或纺锤体形成不正常等情况发生时，细胞周期的运行将不能通过相应的检验点，使细胞周期被阻断。细胞周期检验点由感受异常事件的感受器、信号转导通路和效应器构成，主要的检验点包括G1/S检验点、S期检验点、G2/M检验点和中-后期检验点（纺锤体组装检验点）。（1）G1/S检验点：G1/S检验点在酵母中称为起始点，在哺乳动物中称为限制，点，主要检验细胞中的DNA是否受到损伤，并通过一系列环节调控细胞是否可以由静止状态的G1期进入DNA合成期。相关的检测事件也包括细胞外环境是否适宜及细胞体积是否足够大等。ATM和ATR是迄今为止所知道的感受DNA损伤信号最上游的分子。这两种蛋白都是磷酸肌醇3-激酶的同源物，也称PIKK。ATM主要应答DNA双链断裂引发的信号，而ATR则能够应答所有类型的DNA损伤。ATM和ATR被激活后可以磷酸化多种蛋白质，包括Chk1、Chk2和P53等。Chk1和Chk2的作用底物是Cdc25A，结果是暂时性阻断G1/S进程。磷酸化的P53能够在细胞核中积累，激活包括P21在内的一系列基因的转录。P21𝑐𝑖𝑝/𝑤𝑎ℎ𝑙可以抑制Chk2的活性，并可以结合在CDK4-周期蛋白D复合体上，抑制该复合体对Rb蛋白的磷酸化。Rb蛋白是转录活化因子E2F的抑制蛋白，磷酸化状态的Rb蛋白有利于E2F的释放。Rb蛋白的磷酸化水平降低，将使E2F不能脱离Rb蛋白的控制，从而失去转录活化因子的作用，这样细胞被阻断在G1/S，不能开始DNA复制。（2）S期检验点：S期检验点主要检验DNA在S期复制过程中是否受到损伤。S期损伤的早期感受分子也是ATM和ATR，它们感受和传递DNA损伤信号的路径与G1/S的情况相似，即分别为ATM-Chk2-Cde25A-CDK2通3路和ATR-Chk1-Cdc25A-CDK2通路。信号传递的结果，一方面是暂时地和可逆地抑制尚未起始的复制起始位点，即晚期复制起始位点的启动，使DNA复制速度减慢，甚至停止；另一方面使ATM激活与DNA修复相关的蛋白质（如NBS1等），促进DNA的修复过程。S期细胞中损伤的DNA需要得到有效修复后，细胞周期才能通过S期检验点。（3）G2/M检验点：G2/M检验点是决定细胞一分为二的控制点，主要检测DNA在G2期是否有损伤，细胞中合成的物质是否足够多，细胞的体积是不是足够大等。感受G2期DNA损伤的效应分子也是ATM和ATR蛋白，其下游的Chk1或Chk2都是通过下调Cdc25A/C，同时上调Weel，最终使CDK1/细胞周期蛋白B的活性受到抑制，导致细胞被阻断在G2/M交界点上。另外，P53和P21𝑐𝑖𝑝/𝑤𝑎ℎ𝑙在G2/M检验点也起重要作用，其机制可能是通过P21𝑐𝑖𝑝/𝑤𝑎ℎ𝑙对CDK1/细胞周期蛋白B活性的抑制作用来实现的。（4）中-后期检验点：中-后期检验点也称纺锤体装配检验点，主要检验纺锤体是否装配完好，纺锤丝微观是否已连接到染色体的动粒上。当纺锤丝未能正确地与染色体连接时，APC的活性受到抑制，使姐妹染色单体不能分离，从而阻止了细胞从有丝分裂中期向后期的过渡，保证了复制后的染色体能够均等地分配到两个子细胞中。染色体的任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会引起细胞周期中断在有丝分裂中期和后期的交界处。4三、P53基因的研究探索历程。p53被称为“基因组卫士”，最早于1979年发现，只是最初曾认为p53基因是一种有显性转化作用的核内癌基因。但随着近十年研究的深入，p53基因作为抑癌基因的功能逐渐被揭示出来。在人类50%以上的肿瘤组织中均发现了p53基因基因的突变，这是肿瘤中最常见的遗传学改变，说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。直到1988年,才提出p53基因是一种肿瘤抑制基因。p53基因相继在人类、猴、鸡和鼠等动物中发现，人类p53基因全长约20kb,是位于17号染色体短臂上的一个单拷贝基因，包含11个外显子和10个内含子,其mRNA长2.5kb，编码一个含有393个氨基酸的蛋白质，分子量为53kD。该蛋白是一种核结合蛋白，含有3个主要功能区：①N末端转录激活区，可激活转录，介导蛋白间相互作用，这一区域还可与p53的负调控因子结合；②中央DNA核心结合区，这一区域具有特异性结合DNA的功能，并且是肿瘤细胞突变热点区域；③C末端非专一DNA结合区,包括核定位信号区和核输出信号区。转录调节因子p53作为一种抑癌基因，可诱导细胞生长阻滞，细胞凋亡，细胞分化以及DNA修复。但p53突变体可能会使野生型p53基因的抑癌功能失活,甚至发挥癌基因的功能。随着分子生物学技术的发展，人们对p53基因调控网络有很多新的认识。肿瘤抑制基因的研究已经成为继癌基因之后肿瘤遗传学、分子生物学领域的前沿和热点，尤其是抑癌基因p53越来越被人们重视。研究表明正常的p53,又称野生型p53，在细胞损伤后的修复过程中发挥重要作用。正常p53的功能像“分子警察”一样监视着基因组DNA的完整性。在细胞发生DNA损伤时,p53蛋白能使细胞分裂终止在G1/S期,以使细胞有足够的时间修复损伤,恢复正常状态。若不能修复，野生型p53还能启动细胞的凋亡过程从而引发细胞的程序性死亡,阻止具有癌变倾向的突变细胞产生。而突变型p53基因会导致肿瘤的发生,大多数肿瘤与p5的突变有关。p53的表达：p53是应激性蛋白，在正常情况下，p53以野生型形式存在,维持较低水平，在细胞中不发挥作用。只有在细胞受到刺激后，引起细胞核内p53水平的升高，p53才开始发挥其细胞周期阻滞、细胞凋亡、维持基因组稳定等转录因子的功能。一般把激活p53的信号分为三类：①基因毒应激引起的p535活化。由紫外线、X射线、γ射线、致癌物、细胞毒及一些药物等所引起DNA损伤，导致各种蛋白激酶被激活。②癌基因激活引起p53的活化。如Ras、Myc癌基因等能够诱导可变阅读框基因所表达的蛋白增加，通过ARF与MDM2的结合，下调MDM2蛋白，引起p53水平升高。③非基因毒应激引起的p53活化。如应激、缺氧及核苷酸耗竭等信号，激活各种应激激酶，促使p53在苏氨酸81位残基发生磷酸化,增强了p53的稳定性。p53的突变：在肿瘤发生过程中，p53丧失了保护基因组完整性的功能，主要是因为p53突变导致了其DNA结合核心区域单链残基改变所致。研究发现，p53的突变主要是错义突变，常常发生在特定编码区，如175,245,248,249,273和282，也就是常说的突变热点区,这些位点对p53蛋白的癌抑制功能非常重要。因此，这些位点发生突变，导致p53的DNA结合区域单链残基改变，而失去转录下游因子发挥肿瘤抑制功能，从而导致肿瘤的发生。在大多数人类肿瘤中，p53突变的发生率超过半数，而随着p53研究的深入，发现禽白血病、牛白血病及犬的结肠直肠癌、乳腺瘤等动物的肿瘤疾病也有p53的突变。虽然p53的突变导致肿瘤的发生，但研究发现突变的p53在体外能够结合DNA，保持野生型构象，而在体内没有转录活性。近年来，随着对p53基因的深入研究，p53家族的其他成员也不断被发现,包括p73和p63。它们与p53功能非常相似，都能激活p53相关靶基因，引起细胞周期停滞及细胞凋亡。KarenH等研究表明突变的p53能够通过其DNA结合核心区与p63和p73相互作用，下调它们的功能。而在结构上，它们具有与p53同源的DNA结合域。展望：P53基因在细胞周期中的重要作用已经成为人们关注的焦点，p53基因的突变分析及p53蛋白的调控通路研究为肿瘤治疗提供新的思路。由于p53具有“分子警察”的功能，可引起细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡，为癌症的治疗提供希望,与此同时它可调控干细胞的增生来替代已损伤细胞，将为肿瘤治疗中避免机体的衰老过程提供理论依据。针对p53的抗肿瘤药物已经上市。基因药物是针对肿瘤发病机制的治疗手段，它为肿瘤治疗开拓光明的前景。随着p53基因基础及临床研究的逐步深入，p53基因药物必将成为一种有效的肿瘤治疗手段并在肿瘤防治中发挥重要作用。6