细菌的分离及注意事项

2.注意事项：1）分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。例如：链球菌在普通琼脂不长，要加血清或血液。大肠杆菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即可生长。2）防止污染。分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。3）防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。4）初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯化培养。然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定，。还可以反过来做抹片染色观察。3.分离培养的方法：主要分需氧菌的分离培养方法、厌氧菌的分离培养方法和需要CO菌的培养分离方法。1）需氧菌的分离培养法（1）平板划线法：划线后有单个菌落，便于观察菌落的形态、溶血性等。方法左手拿琼脂平板，使其与水平面成45。角；右手拿铂金耳，使之与水平面平行，靠近酒精灯火焰操作。将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌，待其冷却后，蘸取欲检材料少许，注意不要划破琼脂，不要划得太疏，以免造成浪费，不要重复划线，以免形成菌苔。划线方法：方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线，选择其中一种进行划线。划毕，将接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被检材料名称及日期，倒转置恒温箱中培养。2）厌氧菌的分离培养方法厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在。故在培养厌氧菌时，必须创造一个厌氧环境，一般以降低氧的张力或保持减低的氧张力为原则。目前应用于厌氧菌的分离方法颇多，现就其中较简便且常用的几种方法介绍如下：（1）焦性没食子酸法利用焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧的原理进行厌氧培养。通常100cm3空间用焦性没食子酸1g，10%氢氧化钠或氢氧化钾10ml。具体方法有下列有平板培养法、干燥器培养法。平板培养法是将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的内面中央，其上滴加10%氢氧化钠溶液约5ml；在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没食子酸约0.5g,注意暂勿使两者接触，立即将已接种好的平板覆盖于平皿盖上，，迅速用融化的石蜡密封平皿边缘周围。封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触，然后置37℃恒温箱中培养之。干燥器培养法是于干燥器底部放入氢氧化钠溶液适量，然后再放入2-3个略高于液面的玻璃圆柱（如链霉素小瓶），将适量焦性没食子酸用纸或纱布包好，放置于圆柱上面，使暂勿与氢氧化钠接触，然后放下隔板，将已接种的培养皿或试管置于隔板上，待一切准备好后，将盖盖好密封，并轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中。（2）高层琼脂柱摇震培养分离法取长约15cm，直径约5mm的玻璃棒一支，一端塞以小木塞，另一端塞以棉花塞，高压灭菌备用；加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷却至50℃左右，接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀；在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基，注入上述（1）准备好的玻璃管内，置恒温箱中培养。（3）连二亚硫酸钠法将已接种的平板或斜面培养基，置于一玻璃干燥器内（预先测出体积），按每1000ml容积称取连二亚硫酸钠（又称保险粉）和无水碳酸钠各4g，并分别研细均匀，临用前混合置于一平皿内，放在培养基上层，然后将盖盖严，用凡士林密封，置37℃恒温箱中培养。2）二氧化碳培养法少数细菌如布氏杆菌（牛型），在含有10%二氧化碳的环境下生长良好。要创造这样的环境，常用的方法为烛缸法。将接种的培养基置玻璃干燥器或其他可以密闭的玻璃缸内，于其内点燃一小段蜡烛，加上盖（盖边涂凡士林以防漏气），约一分钟左右蜡烛熄灭，此时缸内氧气已被耗尽，缸内所含二氧化碳约10%。注意蜡烛勿太长，而且不宜靠近缸壁，以免因局部玻璃过热而破裂。凡士林不能太多也不能太少，多了盖子滑落，少了则封口不严。