乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)操作说明

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）操作说明【产品名称】通用名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)英文名称：DiagnosticKitforQuantificationofHepatitisBVirusDNA(PCR-FluorescenceProbing)【包装规格】32人份/盒【预期用途】乙型肝炎病毒是乙型病毒性肝炎的病原体，具有较强传染性，传播途径复杂，流行面广，发病率高等特点，可导致急慢性乙型肝炎，淤胆型肝炎，严重的可导致急性肝衰竭，临床上主要表现为肝功能损害，部分患者可有黄疸。隐形感染较为常见。目前临床上常用的HBV检测方法主要有酶免疫法、化学发光法检测HBV标志物和核酸检测HBVDNA方法。本试剂盒定量检测人血清和血浆样本中的乙型肝炎病毒DNA，主要是通过对乙肝患者血中HBVDNA基线水平和变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测。检测结果仅供临床参考，不能作为患者病情单独的评价指标，必须结合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行评价，亦不能作为血液筛查HBV病毒的筛查试剂使用。【检验原理】本品基于TaqMan探针实时荧光PCR技术。在PCR反应过程中，同时利用Taq酶的5’→3’聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得TaqMan探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射，FAM荧光检测乙型肝炎病毒，JOE/RED610nm波长通道检测内参。本品使用外源性内参，可以监控和避免由于样本中的PCR抑制物或操作不当引起的“假阴性”结果。【主要组成成份】组份名称装量每个反应中的用量主要成份1核酸提取液A3×1.1ml/管100μl聚乙二醇、NaCl2核酸提取液B2×1ml/管50μlNaOH、SDS、Tween-20、Chelex-1003内参160μl/管3μl合成病毒4MgCl2450μl/管13μlMgCl25PCR缓冲液A480μl/管15μlBuffer、dNTPs6Taq酶160μl/管5μlTaq酶、UNG酶7HBV引物探针320μl/管10μlHBV引物和探针，内参引物和探针8阴性对照100μl/管－HBV阴性血清9阳性血清对照100μl/管－HBV阳性血清10弱阳性血清对照100μl/管－HBV阳性血清11定量校准品1号（7.5×107IU/ml）15μl/管7μl寡核苷酸片段12定量校准品2号（7.5×106IU/ml）15μl/管7μl寡核苷酸片段13定量校准品3号（7.5×105IU/ml）15μl/管7μl寡核苷酸片段14定量校准品4号（7.5×104IU/ml）15μl/管7μl寡核苷酸片段15定量校准品5号（7.5×103IU/ml）15μl/管7μl寡核苷酸片段注：不同批号试剂盒中各组份不能互换。自备实验耗材：适用规格的离心管、微量移液器等。【储存条件及有效期】-20℃保存12个月。探针若单独储存，应注意避光。【适用仪器】本品适用于AB7300/7500/Mx3000P/LightCycler480/SLAN实时荧光定量PCR仪。【样本要求】用一次性的针筒抽取病人静脉血1ml，置于灭菌的一次性试管中室温自然凝固或800～1600g离心20分钟，取分离出的血清0.2ml左右送检。血清标本2～8℃可放置72小时，-70℃可长期保存，标本不宜反复冻融。【检验方法】1.试剂配制按样本数（样本数＝待检血清样本数＋血清对照品3个＋定量校准品5个）n配制反应液：取PCR缓冲液An×15μl、HBV引物探针n×10μl、Taq酶n×5μl、MgCl2n×13μl至于一离心管中混匀；低速离心数秒，按43μl/管分装到反应管中。2.内参配制将n×3μl内参（单通道仪器不加内参）及n×50μl核酸提取液B至于一新离心管中混匀备用（混合后避免反复冻融使用，使用前混匀5秒钟）。3.样本、对照品的处理样本处理：取100μl待检血清样本（冻存血清使用前在室温融解，振荡混匀10秒钟）分别加入100μl核酸提取液A，振荡混匀10秒种，12000rpm离心10分钟，弃上清；分别加入50μl核酸提取液B与内参的混合液至沉淀中（使用前一定要充分混匀，将颗粒和液体一起加入沉淀中，其中颗粒量应在15％以内），振荡混匀10秒钟，100℃保温10分钟，12000rpm离心2分钟。处理后的样品应在1小时内使用，或在-20℃～-80℃最长保存1个月（不宜反复冻融）。血清对照品处理：按照血清标本处理方法处理试剂盒内阳性血清对照、弱阳性血清对照、阴性对照。（冻存血清对照品使用前在室温融解，振荡混匀10秒钟）。定量校准品处理：定量校准品无需处理，在样本加样前直接将定量校准品1号至5号振荡混匀10秒钟，低速离心数秒后加样。4.样本加样将样品处理上清液（冻存样品使用前室温充分融化，振荡混匀数秒，12,000rpm离心2分钟）、阳性血清对照、弱阳性血清对照、阴性对照以及定量校准品各7μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置定量PCR仪上。5.仪器扩增程序1、ABI7300/7500/Mx3000P/SLAN双通道仪器：反应管先在50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按94℃10秒→60℃45秒循环40次。60℃采集FAM、JOE荧光通道的信号。2、LightCycler480仪器：反应管先在50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按94℃10秒→60℃45秒循环40次。60℃采集FAM、RED610荧光通道的信号。3、单通道仪器：反应管先在50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按94℃10秒→60℃45秒循环40次，60℃采集FAM荧光通道信号。6.质量控制试剂盒中提供定量校准品五个，阴性对照，阳性血清对照和弱阳性血清对照各一个。如试剂质量完好并操作正确，阳性血清对照、弱阳性血清对照、定量校准品应表现为阳性结果，阴性对照应表现为阴性结果，阳性血清对照定量值为5.0±2.5×105IU/ml，弱阳性血清定量值为5.0±2.5×103IU/ml。如超过范围则实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。在每次检测中都应设置阴阳性对照品。7.结果判断仪器程序运行完成后，按软件要求进行结果保存，输入HBV定量校准品的量值，选择自动分析模式，软件将自动给出标准曲线并计算各样本的HBVDNA含量Q(IU/ml）。定性实验：样本的结果判断：FAMCt值内参Ct值结果判断Ct＜38Ct＜36阳性38≤Ct＜40Ct＜36检测灰区，建议重复检测2次，如检测结果至少1次仍为FAM通道Ct40判断为阳性Ct≥40Ct＜36阴性Ct≥40Ct≥36存在PCR抑制物，或操作不当，应对样本重新提取扩增复检，或者重新采集样本复检注：1、灰区的标本，需要重复2次，如检测结果至少1次Ct40判断为阳性。否则判断为阴性。2、该次检测有效时，应检查每个样本内参通道的Ct值，Ct值的有效范围为23-36，同时呈现明显的S型扩增曲线。定量实验：当5个定量校准品的定量标准曲线的相关系数0.99时，定量实验有效。此时，样本中HBVDNA含量＝Q（IU/ml）。【对检验结果的解释】本品检测结果阳性提示体内HBV处于复制状态，定量值越高，病毒含量越多，复制越活跃。本品仅用于辅助诊断，需要进一步结合其它指标进行诊断。本品检测样本中乙型肝炎病毒DNA含量，但不能表明是否存在活性病毒。【检验方法的局限性】本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。不合理的样本采集、转运、储存及处理过程均有可能导致错误的检测结果。临床实验室应严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》配备设备及操作人员，应严格按照说明要求进行操作。检测仅限于规定的样本类型及适用机型。【产品性能指标】阴性参考品符合率：对阴性参考品检测结果全部阴性，未出现假阳性。阳性参考品符合率：对阳性参考品检测结果全部阳性，未出现假阴性。线性和灵敏度：对线性和灵敏度参考品检测定量结果与标示值的最大偏差不超过±50％，相关系数不小于0.99，最低检出量为4.2×102IU/ml。精密度：检测精密性参考品，量值对数值变异系数CV（n=10）≤5％。基因型检测能力：可检出常见基因型A型、B型、C型和D型。分析特异性：下列物质经验证对检测没有干扰。交叉反应（最高浓度）干扰物质（最高浓度）甲型肝炎病毒（1.0x106copy/ml）人白蛋白(75g/L)丙型肝炎病毒（1.4x107IU/ml）胆红素(35uM)人类免疫缺陷病毒1型（2.3x106IU/ml）游离血红蛋白(120g/L)甲型流感病毒H1N1（1.5x106PFU/ml）甘油三酯(10mM)人巨细胞病毒（1.2x106copy/ml）总IgG(17g/L)E-B病毒（3.4x106copy/ml）普通干扰素α-2a(300U/ml)单纯疱疹病毒1型F株（1.0x108PFU/ml）拉米夫定(6.5ug/ml)单纯疱疹病毒2型333株（1.0x109PFU/ml）阿德福韦酯(35ng/ml)金黄色葡萄球菌CMCC26001（1.7x108个/ml）恩替卡韦（10ng/ml）白色念珠菌CMCC98001（4.3x107个/ml）肝素钠（20IU/ml）痤疮丙酸杆菌（6.1x106个/ml）EDTA（2.0mg/ml）【注意事项】1.开始检测前请仔细阅读本说明全文。2.核酸提取一定要在样本采集后48小时内尽快进行，否则DNA会发生明显降解。不能尽快进行的，应参照【样本要求】保存。3.实验中所用器具均应经过灭菌处理。4.使用本品时，应遵循临床基因扩增实验室的技术要求进行操作。5.加样时应使样本完全落入反应液中，不应有样本粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。6.样本处理等步骤须在生物安全柜或其他防护设施中进行。7.实验室人员必须经过专业培训。8.实验过程应分区进行（试剂准备区、样本制备区、扩增和产物分析区），实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区个阶段用品不得交叉使用；各区间人员流动及空气流向应有严格要求，最大限度避免交叉污染。9.实验用消耗品（如离心管、吸头等）应有合理的清洁和质检程序，避免污染或扩增反应抑制物造成假阴性结果。10.本品仅用于体外诊断。【参考文献】1.戴志澄,祁国明.中国病毒性肝炎:血清流行病学调查(上卷).北京:北京科学技术文献出版社,1997.60-71.2.HollandPM,AbramsonRD,WatsonRandGelfandDH.Detectionofspecificpolymerasechainreactionproductbyutilizingthe5'to3'ExonucleaseactivityofThermusaquaticusDNApolymerase.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA,1991,88:7276–7280.3.WHO实验室生物安全手册3.04.临床基因扩增检验实验室工作规范【联系方式】上海市宝山区城银路830号（200444）电话：[phone]传真：[phone]免费咨询热线：8008207902（座机用户）4008207902（手机用户）