试验方案(草案)

二、研究方案（一）试验方案研究一玉米根系、叶片蛋白质组双向电泳技术体系的建立与优化1、研究目的通过采用不同蛋白裂解液配方进行玉米根系、叶片的双向电泳，比较各种方法跑胶的效果，选择最佳的提取方法，建立符合该组织和系统的双向电泳技术体系。2、研究内容3、试验方案（1）、供试材料：耐淹型浚单20（XD20）或敏感型登海662（DH662）（2）、试验设计：随机区组试验设计，4次重复。在人工气候室进行培养，正常条件下培养，在两叶一心期取其根系、叶片，置于-80C下保存，备用。（3）、取样：取样时，将根系在流水下清洗干净后，将整个根系和叶片取下，备用，如不立即使用，置于-80C保存。提取时，将所取根系、叶片分别混合，液氮研磨后平均分为三份。（4）、操作方法：蛋白质的提取方法A、TCA-丙酮沉淀法法(TCA／acetoneextraction)参考Damerval的方法，略作改动1)使用之前将一份丙酮在-20C下放置至少15分钟；每份样本大约需2mL丙酮，确认样本管是采用丙酮耐受材料制成；2)精确测量每份样本的体积，将每份样本分装入2个离心管中，每个管中4倍样本体积的预冷丙酮（含10%三氯乙酸，和0.1%DTT）；3)在-20C下沉淀蛋白质至少2小时；4)在2-8C下以大约13000xg的离心力（小型微离心设备，13000rmp）将蛋白质离心10分钟（将离心管按照公认位置置于离心设备中，盖冲外，有利于检测小蛋白质沉淀）；5)轻轻倒出丙酮，不要搅散离心沉淀，可采用干净的吸水纸小心将丙酮液滴从沉淀上吸去；6)风干沉淀（一般在室温下5-10分钟），不要过度干燥（注意如果过度干燥，再溶解就会很困难）；7)用合适的缓冲液将沉淀样本再溶解；8)如果不立即使用，可储存于-20C或-70C条件下。B酚提取法(TCA／acetone／phenolextraction)1）、取新鲜玉米组织2g，液氮中迅速研磨成细粉；2）、加入1.5倍苯酚和1.5倍的苯酚提取液，5000rpm离心10min，收集上清液；3）、再加入1倍体积的酚提取液，再次5000rpm离心10min，收集上清液；4）、加入0.2倍体积的甲醇，-70C冰箱保存过夜；5）、离心、清洗沉淀，用200μl的甲醇缓冲液（内含0.1MNH4AC，1%β-Me）,离心去上清液；6）、重复上述5步骤，往沉淀中加入80%丙酮200μl，离心沉淀保存在-4C中待用。*C聚乙二醇沉淀法（备用，不做详细介绍）1）、精确测量每份样本的体积，将每份样本分装入2个离心管中，取100～150ml50%PEG溶液加入到100ml蛋白样品中，缓慢搅拌60min，至完全沉淀，然后离心收集蛋白质沉淀。2）、风干沉淀（一般在室温下5-10分钟），不要过度干燥（注意如果过度干燥，再溶解就会很困难）。裂解液配方：A、8M尿素（可增至9M或9.8M），1%（m/v）DTT，2%～4%（m/v）CHAPS，2%（v/v）两性电解质（pH3～10）,10MPefabloc蛋白酶抑制剂。B、7M尿素，2M硫脲，1%（m/v）DTT，2%～4%（m/v）CHAPS,2%(v/v)两性电解质（pH3～10），10MPefabloc蛋白酶抑制剂。根系蛋白质提取方法：1)TCA-丙酮沉淀法与配方A2)苯酚提取法与配方A3)TCA-丙酮沉淀法与配方A4)苯酚提取法与配方A5)聚乙二醇沉淀法与配方A叶片蛋白质提取方法：1）、TCA-丙酮沉淀法与配方A2）、TCA-丙酮沉淀法与配方B3）、苯酚提取法与配方A蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定采用Bradford法，1）、试剂：①标准蛋白质溶液，用g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。②考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。2）、器材：①可见光分光光度计②旋涡混合器③试管16支操作方法1）、标准方法①取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。②加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlg—250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表管号12345678910标准蛋白质(1.0mg/ml)00.010.020.040.060.080.10未知蛋白质(约1.0mg/ml)0.020.040.06蒸馏水0.10.090.080.060.040.0200.080.060.04考马斯亮蓝g－250试剂5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0每管中的蛋白质量（mg）光吸收值（A595）3）、用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。第一向等电聚焦1）、从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），置室温溶解；2）、在小管中加入0.01gDTT，Bio-Lyte4-6、5-7各2.5ml，充分混匀；3）、从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀；4）、从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cmpH4-7），室温中放置10分钟；5）、沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布；6）、当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层；7）、分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外；8）、在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上；9）、对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。平衡聚焦结束的胶条应立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存，IPG胶条需要平衡两次，每次15min。1）、每10ml平衡缓冲液中加入0.1gDTT,平分装于两支玻璃管中（相当于平衡缓冲液Ⅰ），等电聚焦后，取出IPG胶条分别放入不同标号的玻璃管中（一支玻璃管只能放入一条IPG胶条），用封口膜封口，缓慢震荡15min,倒掉平衡缓冲液Ⅰ；2）、每10ml平衡缓冲液中加入0.4g碘乙酰胺，平分装于两支玻璃管中（相当于平衡缓冲液Ⅱ），方法同第一次平衡；3）、用ddH2O润洗IPG1秒钟，将胶条的边缘（垂直、弯放）置于湿润的滤纸上几分钟以除去多余的平衡缓冲液。第二向SDS电泳1）、装好灌胶模具，倒入凝胶溶液，在每块胶上加入覆盖液以得到平的凝胶上样平面；2）、灌胶之后立即在每块凝胶上铺上一层水饱和的正丁醇或异丁醇，以减少凝胶暴露与氧气，形成平展的凝胶面；3）、凝胶聚合后，倒掉覆盖在凝胶上的正丁醇溶液，并用凝胶储存液冲洗凝胶表面；4）、暂时不需要的凝胶可用塑料薄膜包好于4℃保存1-2天；将整个凝胶模具完全浸没在凝胶储存液中可4℃保存1-2周；5）、电泳槽中装满电泳缓冲液，并打开温控系统，调节温度为15℃；6）、将平衡好的IPG胶条小心放置于SDS胶面上，并轻压使IPG胶条与SDS脚面充分结合，上面覆盖2ml热的琼脂糖溶液（75℃），使琼脂糖在5min内凝固。其余的IPG胶条重复上述操作；7）、将胶盒插入电泳槽中，开始电泳。采用垂直式SDS胶电泳；8）、当溴酚蓝燃料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳；9）、泡好的胶转移到染色盒里固定，准备染色。染色（考马斯亮蓝染色）1）、固定20%TCA1h2）、染色0.1%CBBin40%Eton/10%aceticacid2h3）、脱色1%aceticacid2x30min4）、强化1%aceticacidovernight5）、清洗deionizedH2O30min凝胶的图像处理分析和胶内酶切双向凝胶电泳分析及多肽点的质谱鉴定4、拟发表文章写作提纲材料与方法：结果与分析1）、不同方法对玉米根系蛋白2-DE图谱的影响不同提取方法；不同裂解液；不同上样量。2）不同方法对玉米叶片蛋白2-DE图谱的影响不同提取方法；不同裂解液；不同上样量。一、试验设计与处理（一）、不同基因型玉米不同组织淹水响应的差异蛋白质表达1、试验材料与方法本实验采用盆栽方式，将耕层土壤过筛，混匀后装盆并施入底肥。供试样品为：耐淹型品种浚单20（XD20），敏感型品种登海662（DH662）。在两叶一心期将其全部置于水中，并保持水层高于土壤表面2.5cm，对照正常供水。设5个处理：淹水0、2、4、6、8天。每个处理均设对照，重复4次。在试验处理期间，定期加水以保持水面，其他栽培管理同生产。每个品种种36盆，两个品种共72盆。（二）、淹水时期和持续时间对不同基因型玉米蛋白表达的影响1、试验设计：采取裂区设计，主区为品种，副区设置4种处理方式，每个处理4次重复。供试品种：耐淹型品种浚单20（XD20），敏感型品种登海662（DH662）处理1：对照处理2：淹水1天处理3：淹水3天处理4：淹水5天分别在3个生育期进行淹水处理：苗期（出苗后10天开始处理）、穗期（小喇叭口开始处理）、花粒期（吐丝后30天）施肥管理：一次性施足底肥，玉米生育期较长，会不同程度上造成玉米后期脱肥，影响产量；另外一次性施入底肥，用量大，易烧苗，，会给玉米一播全苗造成影响，所以应玉米底肥和追肥相结合。一般每亩施用优质复合肥20～25Kg。在玉米生长期长期追施尿素20Kg，这样施肥既能保证田间玉米的正常施肥：N：P：K=25:10:18,4500株/亩。氮肥：每株应共施入25x2x500/4500=5.56g的氮肥。氮肥分两次施入，拔节期（六片叶全展开）施40%的氮肥，大喇叭口期（10-11叶期）施60%的氮肥。尿素含氮46%，因此应于拔节期施入4.83g的尿素/盆，大喇叭口期施入7.25g的尿素/盆。磷肥：于拔节期施入P2O5:10x2x500/4500=2.22g折合成磷肥（16%）：13.875g/株。钾肥：于拔节期施入K2O：18x2x500/4500=1.0g，折合成氯化钾（60%）：6.67g/株。二、技术流程（一）、取样（二）、二维凝胶电泳（三）、图像分析（四）、质谱分析