豌豆凝集素基因的克隆与转化烟草的研究

豌豆凝集素基因的克隆与转化烟草的研究周小全，张兴国＊（西南大学园艺园林学院蔬菜实验室重庆400716）摘要：豆科植物凝集素在植物对其相应的根瘤菌识别中起重要作用。设计特异引物扩增出豌豆(PisumsativumL.)凝集素基因(psl)，并亚克隆到植物表达载体pVCT2020中，经根癌农杆菌EHA105介导,采用叶盘法转化烟草（NicotianatobacumL.）。通过PCR分析鉴定Kan阳性植株。鉴定过程中排除了农杆菌DNA干扰造成PCR假阳性的可能，证明psl基因已经整合到烟草基因组中。该转基因烟草可进一步用于与豌豆根瘤菌的相互作用分析。关键词：豌豆凝集素；DNA克隆；转化；烟草；PCR；鉴定CloningofPeaLectinGeneandItsTransformationintoTobaccoZhouXiao-Quan，ZhangXing-Guo＊（CollegeofHorticultureandlandscapeArchitecture,SouthwestUniversityChongqing400716China）Abstract:Theleguminouslectinsplayanimportantroleinrecognitionofhostplantstotheirownrhizobia.ThepealectingenewasamplifiedbyPCR,usingspeciallydesignedprimers.ItwasthensubclonedintoplantexpressionvectorPcvt2020.Tobaccowastransformedbyco-cultivatingleafdiscviaAgrobacteriummediation.TheregeneratedKanamycin-resistanttransformantswereanalyzedbyPCR,eliminatinginterferencefromtheAgrobacteriumDNA.TheseresultsindicatedthepealectingeneintegratedintothetobaccogenomicDNA.ThistransgenicplantscouldbeusedinresearchesontheinteractionwithRhizobia.Keywords:pea；lectin；DNAcloning；transformation；tobacc；PCR；identification氮素在农业生产中一直发挥着重要作用，全球每年可供利用的还原态氮中约有60％来自生物固氮，其中豆科植物固氮量占82%[1]。提高生物固氮的量不仅可以降低能源消耗还可以减少环境污染。人们试图通过分子生物学手段打破根瘤菌的宿主专一性障碍，从而扩大共生固氮的范围。Hamblin等1973年首次报道了根瘤菌与凝集素的相互作用，他们提出假说：与菜豆凝集素相结合的根瘤菌到达菜豆的根部，在适当的位点感染植物[2]。Boblool等1974年指出凝集素在宿主植物专一性识别根瘤菌的过程中起着特殊作用，豆科植物凝集素在豆科植物根表面与适当的根瘤菌表面的特异性多糖产生特异性的相互作用[3]。Dazzo等1985年提出：三叶草根瘤菌吸附到三叶草根表面时,以其凝集素作为中介，使三叶草根瘤菌选择性地在三叶草根毛上积累[4]。Díaz等1989年报道：在豆科植物和根瘤菌共生作用中，宿主植物的凝集素起决定作用[5]；他在1995年用转豌豆凝集素基因（psl）的三叶草接种豌豆根瘤菌，获得结瘤固氮功能[5]。这些研究成果说明，凝集素基因的转化可以扩大根瘤菌的宿主范围。在非豆科植物转化方面，EdwardsGA等1991年将psl转入了马铃薯，但是未进行进一步的结瘤固氮方面的研究。张静娴、荆玉祥等利用CaMV35S启动子将psl转化到烟草与水稻中，并获得了表达[7、8]。本研究是在克隆了包含启动子和终止序列的psl的基础上，进一步把该基因导入烟草中，从而为深入研究转psl的非豆科植物与根瘤菌相互作用奠定了基础。1材料与方法1.1植物材料豌豆(PisumsativumL.)种子为重庆地区市售的食用豌豆，烟草(NicotianatobacumL.cv.Wisconsin38)为本实验室提供。1.2菌株与质粒大肠杆菌(XL1-blue)和农杆菌(EHA105)，植物表达载体pVCT2020(9.53kb)均由本实验室保存和提供；pMD18-T(2.7kb)质粒载体购自Takala公司。1.3PCR引物及扩增条件PCR目的产物基因为包含启动子和终止序列的psl基因，设计上游引物P1序列为GTTAAGTTCTGATGATGTGGTGTG，下游引物P2序列为CTAATAGAACCCATTCTTGGCAA，反应条件：94℃3分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃2分30秒，循环28次，72℃10分钟。设计特异引物P3、P4、P5。引物P3/P4的目的产物为一段包含NPTⅡ基因，长1.1kb的DNA片断，反应条件：94℃3分钟，94℃30秒，54℃30秒，72℃1分10秒，循环35次，72℃10分钟。引物P3/P5的目的产物为一段包含左边界LB和NPTⅡ基因，长约1.4kb的DNA片断，反应条件：94℃3分钟，94℃30秒，54℃30秒，72℃1分30秒，循环35次，72℃10分钟。1.4植物表达载体的构建以豌豆幼叶中分离的基因组DNA为摸板，用P1/P2为引物进行扩增。将PCR扩增产物加上“A”尾巴后与pMD18-T载体连接，得到质粒pMD-PsL。用XbaⅠ+HindⅢ双酶切质粒pMD-PsL，回收小片段（2kb）亚克隆于pVCT2020相应位点，得到质粒pVCT-PsL。用PmaCⅠ单酶切质粒pVCT-PsL，回收大片段(11.1kb)自环化后得到质粒pVCT-PsL＊（如图1）。质粒的提取、酶切、连接及转化参照文献[9]进行。XbaIHindIIIPmaCILBNPTIIPnosPsL35STnosRB图1表达载体pVCT-PsL＊的结构图Fig.1TheconstructionofexpressionvectorspVCT-PsL＊1.5烟草转化及转基因植株的培养采用液氮冻融法将构建好的植物表达载体pVCT-PsL＊转化到农杆菌EHA105中。PCR检测克隆正确后，采用叶盘转化法，通过农杆菌介导将重组质粒pVCT-PsL＊转化到烟草(NicotianatobacumL.cv.Wisconsin38)中，并按常规方法进行烟草的再生[10]。1.6转基因烟草的PCR鉴定分别提取转基因烟草和未转基因烟草幼叶的基因组DNA[11]。取1μL作为模板，分别以P1/P2、P3/P4和P3/P5为引物于25μL体系中进行PCR扩增，PCR产物于2%琼脂糖凝胶中电泳。2结果与讨论2.1豌豆凝集素基因的扩增以豌豆gDNA为模板,P1/P2引物PCR扩增出的目的带大小约为2.0kb,与预期的相符。扩增产物与质粒pMD18-T经连接转化，PCR筛选后得到质粒pMD-PsL。pMD-PsL经XbaⅠ+HindⅢ双酶切鉴定，得到2.8kb和2.0kb两个片段，与预期结果相符，送于上海生工公司测序。目的基因测序结果（图2）表明，核苷酸序列全长1948bp，其中外显子为828bp，共编码275个氨基酸。与dePater等[12]所报道的已知序列相比，其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为99.4%和100%。其中启动子区域核苷酸序列有9处差异；阅读框区域核苷酸序列有2处差异，但其所编码的氨基酸序列并无不同。分析差异产生的原因主要在于dePater等所用的豌豆材料与我们所用的品种不同，但PCR扩增过程中碱基的错误配对及测序过程中的分析错误依然不能排除。GTTAAGTTCTGATGATGTGGTGTGATAGCTAGGTCATTGGTATAAATTTAAGTCAACATATGTAGTTAAAAATTGATATACTATTTAAACTGCGAGAGTTTTGTTTCTGAAGGTTAAAAATAAATCCCCTTCAGTTTAATGACGTGTAAGTTTTCAACTACATATATTGACTCAGTGACATTTCTTTCATGTCATGTCACAAGAACTTAATATTTTTCCTAGAAATTAACGGAAGAGAACAAATAAGATAAAGAAAGAAGTGAAATTAAAAGATTAACATATAACATTTTTTAATTAAAGAATTAAAACAAAATATTAAATTAAACTAAAAATTTGGTGATTAATTGTGCCAAAAAAATATGATGCAGCTAGATCTTTTAGCTTAATTTTTAATTGGATGAGATGATACCTTAATTTTTAATTGGATGAGATACAAATTTTATCATAAAATATATTAGTTATAACAATACGACCACCCTCTCCATAAGTTTTAAATAAATATCAGCCCTAAAAAACTCTTTAAATAAATTGAAATTTAATGAGTCATATTTTTTTAACATATAAATTTTAATAGTTATCGTACCGAACAAAAACAGTAATCATGATCTAAACCGAACAACCTCGAAGAAATACAAGTTATTACATGCAAAAATATATAGTAATAAATAAATAAACTAGTTAAACAAAATACAATATTTTTTGTCTTCAAAGAAGATTCGATGGACGCGTAGAAAATGATGGGACATGGTGTTGTATATGTGTTTCATTGTAACGCACTATAAAGACACGTAGAATGAGTCATCACCACTATATAAACAAGTAGCATGCATGCATGCATGCAATTATAACCAATAATGGCTTCTCTTCAAACCCAAATGATCTCGTTCTATGCGATATTTCTATCCATTCTCTTAACAACAATCCTTTTCTTCAAGGTGAACTCAACTGAAACCACTTCCTTCTTGATCACCAAGTTCAGCCCCGACCAACAAAACCTAATCTTCCAAGGAGATGGCTATACCACAAAAGAGAAGCTGACACTGACCAAGGCAGTAAAGAACACTGTTGGCAGAGCCCTCTATTCCTCACCTATCCATATCTGGGATAGAGAAACAGGCAACGTTGCTAATTTTGTAACTTCCTTCACTTTTGTCATAAATGCACCCAACAGTTACAACGTTGCCGACGGGTTTACGTTCTTCATCGCACCTGTAGATACTAAGCCGCAGACCGGCGGTGGATATCTCGGAGTTTTCAATAGCGCAGAGTATGATAAAACCACTCAAACTGTTGCTGTGGAGTTTGACACTTTCTATAATGCTGCATGGGATCCAAGCAACAGAGATAGACATATTGGAATCGATGTGAACAGTATCAAATCCGTAAACACTAAGTCGTGGAAGTTGCAGAATGGTGAAGAGGCTAATGTTGTGATAGCTTTTAATGCTGCTACTAATGTGTTAACTGTTAGTTTAACTTATCCTAATTCACTTGAGGAAGAGAATGTAACTAGTTATACTCTTAGCGACGTTGTGTCTTTGAAGGATGTTGTTCCTGAGTGGGTAAGGATTGGTTTCTCAGCTACCACAGGAGCAGAATATGCAGCACATGAAGTTCTTTCATGGTCTTTTCATTCTGAGTTGAGTGGAACTTCAAGTTCTAAGCAAGCTGCAGATGCATAGTTTTTTTGCTTTTCATCATCATGCATGTCAAGTCATGTGTGACAGATCCAGTTTCTATAAA