质粒DNA的制备

实验七质粒DNA的制备【实验目的】1.了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用；2.掌握质粒DNA分离和纯化的原理；3.学习碱裂解法和煮沸法分离质粒DNA的方法。【实验原理】质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞特定的表型。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单个酶切位点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。经过改造的基因工程质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的用途，而质粒的分离与提取则是基因工程最常用、最基本的实验技术。一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法和羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株的类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途选择不同的方法。本实验介绍最常用的碱裂解法和煮沸法提取质粒DNA。1.碱变性法碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。在pH值高达12.6的碱性环境中，染色体的线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而被变性；共价闭环质粒DNA的大部分氢键也断裂，但两条互补链不会完全分离，仍会紧密地结合在一起。用pH4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此可以迅速复性；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能复性，它们相互缠绕形成不溶性网状物，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，用酚-氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA，然后用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒DNA沉淀。2.煮沸法细胞用含有TritonX－100的缓冲液处理，溶解细胞膜。用溶菌酶酶解细菌细胞，然后在高温条件下，使细胞裂解，破坏细菌细胞壁，有助于解开DNA链的碱基对，并使蛋白质和染色体DNA变性。而闭环质粒DNA配对虽被破坏，但双链彼此不分开，当温度下降时恢复成超螺旋。变性蛋白带着染色体DNA一起沉淀下来，质粒DNA仍留在上清液中。离心后的上清液再用异丙醇或乙醇处理，沉淀出质粒DNA。以上两种制备方法的实验过程中，由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，必要时可进一步纯化。提取的质粒DNA中会含有RNA，但RNA一般并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等，因此不必除去。【试剂与器材】（一）菌种和培养基1.大肠杆菌DH5α（含质粒pT-GFP，该质粒为T载体联上了绿色荧光蛋白GFP基因的重组质粒）。2.LB液体培养基(Luria-Bertani)：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.2，加去离子水至总体积1L。分装于150mL三角瓶中，每瓶50mL，置高压蒸气锅以1.034×105Pa，121℃灭菌20分钟。3.氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：用无菌水配成10mg/mL水溶液，过滤除菌，分装成小份存于灭菌有盖离心管中，-20℃保存备用，不宜反复冻溶。（二）试剂1.溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌15min，储存于4℃冰箱。2.溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS（从10%SDS母液中稀释，SDS母液可室温保存），现配现用。3.溶液III：5mol/LKAc60mL，冰醋酸11.5mL，H2O28.5mL，高压灭菌，4℃冰箱保存。溶液终浓度为:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。4.3mol/L醋酸钠(pH5.2)：800mL水中溶解408.1gNaAc•3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100mL，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。5.STE缓冲液：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris•Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。6.STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris•Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)，5%TritonX-100。7.TE缓冲液：10mmo/LTris•Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。8.RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris•Cl(pH7.5)，15mmol/LNaCl中，配成10mg/mL的溶液，于100℃加热15min，使残留的DNA酶失活。冷却后用1.5mLEppendorf管分装成小份保存于-20℃。9.溶菌酶（10mg/ml）：用10mmol/LTris.Cl,PH8.0,新鲜配制。10.TE饱和酚（1）11.酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)：12.氯仿：异戊醇（24:1）：按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇（2）。氯仿可使蛋白变性并有助于水相与有机相的分开，异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。13.电泳所用试剂：（1）TBE缓冲液(5×)：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA(pH8.0)20mL，定溶至1000mL。（2）上样缓冲液(6×)：0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。14.异丙醇15.70％乙醇（二）设备超净工作台，微量取液器(20μL,200μL,1000μL)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。【操作方法】（一）小量制备碱变性法：1.将含有质粒pGFPuv的DH5α菌种划线接种在LB固体培养基（含有100μg/mLAmp）（3）上，37℃培养12-24小时（4）。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mLLB液体培养基(含有100μg/mLAmp)中，37℃振荡培养14~16小时。2.取1.5mL培养液加入1.5mL离心管中，室温12,000r/min离心1分钟收集菌体(视菌体量多少，可重复此步)。3.加入100μL预冷的溶液Ⅰ涡旋振荡悬浮菌体（5）。4.加入新配制的溶液Ⅱ200μL，轻缓上下颠倒离心5次，至溶液澄清(千万不要振荡)，冰浴5分钟（6）。5.立即加入用冰预冷的150μL溶液III，轻柔振荡5~10次（7），冰浴5分钟（8），12,000r/min离心5min。6.取上清移入干净Eppendorf管中，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，剧烈振荡20秒。室温下12,000r/min离心10分钟，可见溶液分三层，上层为质粒DNA溶液，中层为变性的蛋白层，下层为有机相。7.取上清（6），加入400μL氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈振荡20秒。12,000r/min离心10分钟。（选做）8.取上清，加入2~2.5倍体积无水乙醇振荡混匀，沉淀DNA，-20℃放置10min（7）。（或者加1倍异丙醇，室温静置10min），12,000rpm离心10分钟。9.去上清，加入200μL70%乙醇（8），12000g，2分钟。洗涤沉淀两次以去盐。10.将Eppendorf管倒置于一张纸巾上，使液体流出，然后短暂离心，用移液器小心取出残液，这一步操作要格外小心，有时沉淀块贴壁不紧，放离心管于超净工作台蒸发痕迹乙醇。（除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴）。11.将沉淀溶于30μLTE缓冲液(pH8.0，含20μg/mLRNaseA)中（9），储于-20℃冰箱中。如直接酶切，可将沉淀溶于30~50μLddH2O（含20μg/mLRNaseA）。12.利用比色法测定质粒DNA在260nm和280nm下的光吸收值并计算样品浓度。13.用1%琼脂糖凝胶电泳观察质粒DNA的纯度和条带情况。煮沸法1.取1.5ml培养菌体（1）置于离心管中,10000ｇ离心1分钟。2.弃上清（2），将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。3.将菌体沉淀悬浮于350ulSTET溶液中,涡旋混匀。4.加入25ul新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)（3）,涡旋振荡3秒钟混匀。（溶菌酶溶液PH值不能低于8.0，否则溶菌酶就不能有效发挥作用。）5.将离心管放入沸水浴中,时间恰为40秒，12000g，离心10分钟。6.吸出上清移至另一个离心管，或直接用消毒牙签取出沉淀物，在上清中加入40ul5mol/LNaAc（PH5.2）和420ul异丙醇，振荡混匀，室温放置5分钟。7.12000g，4℃离心5分钟，将Eppendorf管倒置于一张纸巾上，使液体流出，然后短暂离心，用移液器小心取出残液，这一步操作要格外小心，有时沉淀块贴壁不紧，放离心管于超净工作台蒸发痕迹乙醇或室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2－5）分钟。8.弃上清，加入1ml70％乙醇，12000g，4℃离心2分钟。按步骤7回收核酸沉淀。9.加入50ulTE（PH8.0）（含无DNA酶的RNA酶20ug/ml），溶解DNA，稍加振荡，储存于－20℃。（二）大量制备碱变性法：1.从平板上挑选一个单菌落，接种到50mL培养基，37℃过夜培养14~16小时。2.将培养物转入50mL离心管，4,800r/min4℃离心10分钟。3.沉淀用10mLSTE洗涤，涡旋打匀，4,800r/min4℃离心10分钟。4.加入3mL溶液I，涡旋，冰浴5分钟。5.加入6mL溶液Ⅱ(现配)，轻柔颠倒数次直至溶液澄清，保持冰浴5分钟。6.马上加入溶液Ⅲ4.5mL，轻柔颠倒5~10次，得到白色沉淀，冰浴3－5分钟。7.4,800r/min4℃离心20分钟，取上清，加入0.6倍体积异丙醇，室温放置10分钟，沉淀DNA。8.4,800r/min室温离心10分钟，去上清，加入75%乙醇，洗涤沉淀。9.4,800r/min离心10分钟，去上清，吸出痕量剩余乙醇，风干。10.加入1.5mLTE溶液，溶解沉淀，转入7mL离心管。11.加入等体积5mol/LLiCl(预冷)，颠倒混匀，冰浴10分钟，沉淀大分子RNA。12.10,000r/min4℃离心10分钟，取上清，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。13.10,000r/min室温离心10分钟，室温放置20~30分钟。用700μl含无ＤＮＡ酶的胰ＲＮＡ酶(20μg/ml）的ＴＥ（pH8.0）溶解沉淀14.转移至1.5mL离心管，加入等体积13%PEG8000/1.6mol/LNaCl，混匀，冰浴10分钟，沉淀双螺旋质粒DNA。15.12,000r/min离心10分钟，去上清，加入1mL75%乙醇，洗涤沉淀。16.12,000r/min离心10分钟，去