第五章克隆基因的表达

《基因工程概论》第一章导论第二章基因操作的工具酶第三章基因克隆的载体第四章基因克隆的策略第五章克隆基因的表达第六章基因工程的基本技术第五章克隆基因的表达第一节基因表达的基本条件第二节原核表达载体的构建第三节克隆基因在植物细胞中的表达第一节基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素1、基因表达的基本过程1、基因表达的基本过程基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。首先，目的基因通过转录(transcription)形成mRNA（信使RNA,messengerRNA)；然后，tRNA（转运RNA,transferRNA）将各种氨基酸运送到核糖体并按照mRNA的密码子顺序将各种氨基酸连接成特定的氨基酸序列(translation)最终得到基因的表达产物（蛋白质）。第一节基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素Transcription(转录):makinganRNAcopyofaDNAsequence.RNApolymeraseopensthepartoftheDNAtobetranscribed.OnlyonestrandofDNA(thetemplatestrand,antisensestrand)istranscribed.转录的具体过程转录的具体过程Antisensestrand有效转录的基本条件Groupsofgenescodingforrelatedproteinsarearrangedinunitsknownasoperons.Anoperonconsistsofanoperator,promoter,regulator,andstructuralgenes.Theregulatorgenecodesforarepressorproteinthatbindstotheoperator,obstructingthepromoterofthestructuralgenes.Theregulatordoesnothavetobeadjacenttoothergenesintheoperon.Iftherepressorproteinisremoved,transcriptionmayoccur.半乳糖苷酶渗透酶转乙酰基酶Operonsareeitherinducibleorrepressibleaccordingtothecontrolmechanism.Seventy-fivedifferentoperonscontrolling250structuralgeneshavebeenidentifiedforE.coli.Bothrepressionandinductionareexamplesofnegativecontrolsincetherepressorproteinsturnofftranscription.启动子（promoter）：在基因序列中，标志着转录起始的可被RNA聚合酶识别的位点(DNA区段)，一般位于基因的上游。终止子（terminator）：位于基因的编码序列之外（一般在下游）的一段标志着转录停止的RNA聚合酶识别位点。有效转录的基本条件Prokaryoticgeneregulationdiffersfromeukaryoticregulation,butsinceprokaryotesaremucheasiertoworkwith,wefocusonprokaryotesatthispoint.PromotersaresequencesofDNAthatarethestartsignalsforthetranscriptionofmRNA.Terminatorsarethestopsignals.mRNAmoleculesarelong(500-10,000nucleotides).第一节基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素TheGeneticCodeTocodeforthe20essentialaminoacidsageneticcodemustconsistofatleasta3-baseset(triplet)ofthe4bases.Ifoneconsidersthepossibilitiesofarrangingfourthings3atatime(4X4X4),weget64possiblecodewords,orcodons(a3-basesequenceonthemRNAthatcodesforeitheraspecificaminoacidoracontrolword).ThegeneticcodewasbrokenbyMarshallNirenbergandHeinrichMatthaei,adecadeafterWatsonandCrick'swork.Thegeneticcodeconsistsof61amino-acidcodingcodonsandthreeterminationcodons,whichstoptheprocessoftranslation.Thegeneticcodeisthusredundant(degenerateinthesenseofhavingmultiplestatesamountingtothesamething),with,forexample,glycinecodedforbyGGU,GGC,GGA,andGGGcodons.正确翻译的基本条件ThegeneticcodeMessengerRNA(mRNA)istheblueprintforconstructionofaprotein.TransferRNA(tRNA)isthetruckdeliveringtheproperaminoacidtothesiteattherighttime.tRNAwillformacloverleafstructureduetocomplementarybasepairing.Atthetopofthelargelooparethreebases,theanticodon,whichisthecomplementofthecodon.Thereare61differenttRNAs,eachhavingadifferentbindingsitefortheaminoacidandadifferentanticodon.Ribosomesaretheorganelle(inallcells)whereproteinsaresynthesized.Theyconsistoftwo-thirdsrRNAandone-thirdprotein.Ribosomesconsistofasmall(inE.coli,30S)andlarger(50S)subunits.ThelengthofrRNAdiffersineach.The30Sunithas16SrRNAand21differentproteins.The50Ssubunitconsistsof5Sand23SrRNAand34differentproteins.ThesmallersubunithasabindingsiteforthemRNA.ThelargersubunithastwobindingsitesfortRNATranslationistheprocessofconvertingthemRNAcodonsequencesintoanaminoacidsequence.Theinitiatorcodon(AUG)codesfortheaminoacidN-formylmethionine(f-Met).NotranslationoccurswithouttheAUGcodon.f-Metisalwaysthefirstaminoacidinapolypeptidechain,althoughfrequentlyitisremovedaftertranslation.TheintitatortRNA/mRNA/smallribosomalunitiscalledtheinitiationcomplex.Thelargersubunitattachestotheinitiationcomplex.Aftertheinitiationphasethemessagegetslongerduringtheelongationphase.NewtRNAsbringtheiraminoacidstotheopenbindingsiteontheribosome/mRNAcomplex,formingapeptidebondbetweentheaminoacids.ThecomplexthenshiftsalongthemRNAtothenexttriplet,openingtheAsite.ThenewtRNAentersattheAsite.WhenthecodonintheAsiteisaterminationcodon,areleasingfactorbindstothesite,stoppingtranslationandreleasingtheribosomalcomplexandmRNA.Oftenmanyribosomeswillreadthesamemessage,astructureknownasapolysomeforms.Inthiswayacellmayrapidlymakemanyproteins.正确翻译的基本条件1、具备起始密码子2、具备终止密码子3、具有正确的阅读框基因表达的基本过程第一节基因表达的基本条件1、基因表达的基本过程2、有效转录的基本条件3、正确翻译的基本条件4、影响克隆基因表达效率的因素4、影响克隆基因表达效率的因素一般而言，所用启动子的强度、DNA的转录其始序列、密码子的选择、mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。a.启动子的结构对表达效率的影响大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即-10区(位于转录其始位点上游5-10bp，故称为-10区，序列为5’--TTGACA)和-35区(位于转录起始位点上游25bp处，一般有10bp组成，故称为-35区，5’--TATAAT)。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17bp，启动子的活性就越强。b.翻译起始序列对表达效率的影响mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。５’--AGGAGGUXXXAUG---mRNA３’AUUCCUCCACUAG-----16SrRNA3’末端c.启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这仪因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。PromoterSDATGGeneTerminatorTAAmRNA第五章克隆基因的表达第一节基因表达的基本条件第二节原核表达载体的构建第三节克隆基因在植物细