第五章基因的表达与调控.

第六章基因的表达与调控(上)——原核基因表达调控模式DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制Contents5．1原核基因表达调控总论5．2乳糖操纵子与负控诱导系统5．3色氨酸操纵子与负控阻遏系统5．4转录后调控原核生物和单细胞真核生物：环境影响蛋白质合成高等真核生物出现细胞分化：不同细胞所合成蛋白质在质和量上均有差异因此，不论真核还是原核细胞都有一套准确地调节基因表达和蛋白质合成的机制如果每个基因等同翻译，每一个多肽应有相同的拷贝数。结论是否定的，基因的表达是被控制的。组成型合成蛋白质适应型或调节型合成蛋白质如DNA合成酶，RNA聚合酶等如β-半乳糖苷酶及参与糖代谢的酶，氨基酸、核苷酸合成系统的酶类等一个系统处于“off”状态时可能是本底水平的基因表达，常常是每世代每个细胞合成1～2个mRNA分子和极少量的蛋白质分子。必须明白所谓“关”实际的意思是基因表达量特别低，或者无法检测。细菌中的基本调控机制有如下规律:一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。这种“开-关”(on-off)活性是通过调节转录来建立的。即通过调节mRNA的合成来实现的5．1原核基因表达调控总论生物信息DNARNAProtein执行生命活动调节基因表达调控基因表达调控在两个水平上体现(1)转录水平上的调控(transcriptionalregulation);(2)转录后水平上的调控(post-transcriptionalregulation)①mRNA加工成熟水平上的调控(differentialprocessingofRNAtranscript)②翻译水平上的调控(differentialtranslationofmRNA)指挥基因调控的信号不同Prok中，营养状况和环境因素——主要Euk中，激素水平和发育阶段——主要在转录水平上对基因表达调控取决于DNA的结构、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。5.1.1原核基因调控机制的类型与特点原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的不同可分为：负转录调控(negativetranscriptionregulation)正转录调控(Positivetranscriptionregulation)负转录调控系统在负转录调控系统中，调节基因的物质是阻遏蛋白(repressor)－－阻止结构基因转录。其作用部位是操纵区。它与操纵区结合，转录受阻。调节基因操纵基因结构基因阻遏蛋白激活蛋白正转录调控负转录调控负转录调控在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭，这样的调控负转录调控。负控诱导系统－－阻遏蛋白不与诱导物结合时，阻遏蛋白与操纵区相结合，结构基因不转录，阻遏蛋白结合上诱导物时，阻遏蛋白与操纵区分离，结构基因转录。负控阻遏系统－－阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。正转录调控系统在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白(activator)，激活蛋白结合与DNA的启动子及RNA聚合酶后，转录才会进行。调节基因操纵基因结构基因阻遏蛋白激活蛋白正转录调控负转录调控正转录调控如果在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入这种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的调控正转录调控。在正控诱导系统中，诱导物的存在使激活蛋白处于活性状态，转录进行。在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态，转录不进行。•可诱导调节：指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。例：大肠杆菌的乳糖操纵子分解代谢蛋白的基因2、根据操纵子对某些能调节它们的小分子的应答，可分为可诱导调节和可阻遏调节两大类：调节基因操纵基因结构基因阻遏蛋白调节基因操纵基因结构基因阻遏蛋白诱导物mRNA酶蛋白酶合成的诱导操纵子模型诱导物如果某种物质能够促使细菌产生酶来分解它，这种物质就是诱导物。•可阻遏调节：基因平时是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。例：色氨酸操纵子合成代谢蛋白的基因酶合成的阻遏操纵子模型调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物辐阻遏物如果某种物质能够阻止细菌产生合成这种物质的酶，这种物质就是辅阻遏物。一般规律可诱导的操纵子是一些编码分解代谢糖和氨基酸的蛋白的基因。这些操纵子常常是关闭的。一旦生存条件发生变化，如葡萄糖缺乏而必须利用乳糖作为能源时，就要打开这些基因。可阻遏基因是一些合成各种细胞代谢过程中所必须的小分子物质（如氨基酸、嘌呤和嘧啶等的基因），这些基因总是打开着的。只有当细菌生活环境中有充分供应时，才关闭这些基因，停止其合成。弱化子对基因活性的影响在这种调节方式中，起信号作用的是有特殊负载的氨酰-tRNA的浓度。当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段DNA序列被称为弱化子。当基因转录使转录产物（RNA）到不同长度时，核糖体会在对应的DNA位置上；此时RNA可以形成某种形式的二级结构；由此决定延伸复合物的结合能力，从而决定基因能否继续转录。细菌的应急反应细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿－－氨基酸的全面匮乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌会产生一个应急反应－－停止包括生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质的几乎全部生物化学反应过程。实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸(pppGpp)。产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的tRNA，这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成。ppGpp的出现会关闭许多基因，以应付这种紧急状况。ppGpp影响RNA聚合酶与这些基因转录起始位点的结合，使基因被关闭。ppGpp与pppGpp的作用范围十分广泛，它们影响一大批操纵子而被称为超级调控因子。5．2乳糖操纵子－－负控诱导系统1、操纵子模型的提出1961年，Monod和Jacob提出获1965年诺贝尔生理学和医学奖JacobandMonod2、操纵子的定义操纵子：是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制。操纵序列O启动序列P——上游含CAP（分解代谢物基因激活蛋白）调控区调节基因I——编码一种阻遏蛋白结构基因Z——-半乳糖苷酶Y——透酶A——乙酰基转移酶乙酰基转移酶半乳糖苷透性酶ß-半乳糖苷酶操作位点3乳糖操纵子结构调节基因一、乳糖操纵子的结构•Z编码β-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖•Y编码β-半乳糖苷透过酶：使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。•A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。•操纵子是一种完整的具有特定功能的细菌基因表达和调节的单位，包括调节基因，操纵位点，结构基因，组成一个控制单元•结构基因：产生mRNA,合成蛋白质•操纵位点promotor,operator：启动子结合位点•调节基因：产生调节蛋白（与操纵位点结合）→结构基因不转录诱导物存在时，可与阻遏蛋白结合→结构基因转录ControlelementStructuralgenes5.2.2酶的诱导现象B-半乳糖苷酶二、酶的诱导——lac体系受调控的证据分解底物的酶只有在底物存在时才出现！无乳糖时，几个β-gal/cell加入乳糖时，5000个再去掉乳糖，lacmRNA下降乳糖能激发lacmRNA的合成乳糖的诱导作用是由酶前体转化而来，还是诱导新酶合成？培养基（35S-aa,无乳糖）→E.coli繁殖→培养基（无35S-aa,加入乳糖）→β-gal(无35S)安慰诱导物：如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解，这种物质被称为安慰诱导物，如IPTG（异丙基-β–D-硫代半乳糖苷）。gratuitousinducer安慰诱导物义务诱导物可诱导半乳糖苷酶产生，但不是其底物IPTG，异丙基巯基半乳糖苷TMG，巯甲基半乳糖苷ONPG,O-硝基半乳糖苷在研究诱导作用时，很少使用乳糖5.2.3调控机理1调控区结构lacI,1045bp，独立PiP,82bp，－82～＋1O,35bp，－7～＋28lacZYA体外结合竞争实验:阻遏物＋RNApol,offRNApol＋阻遏物，on2.阻遏状态未诱导：结构基因被阻遏阻遏物四聚体LacIPOlacZlacYlacA图16-当无诱导物时阻遏物结合在操纵基因上3诱导状态诱导物诱导作用：在可诱导的操纵元中，加入对基因表达有调节作用的小分子后，开启基因的转录活性诱导：基因被打开β-半乳糖苷酶透性酶乙酰转移酶图16-7诱导物和阻遏物成为调节操纵子的开关4诱导物不是乳糖生成lac诱导物乳糖代谢Allolctose异构乳糖别乳糖细胞内β-半乳糖苷酶来源?5.2.4阻遏蛋白的作用机制1阻遏蛋白结构38KD，4聚体，一个亚基结合一个IPTG分子lacI组成型转录Pi弱启动子，5－10个／cell具有二重性阻止转录（与lacO结合）开始转录（与诱导物结合）阻遏蛋白单体的结构Helix-turn-helixCoredomain1Coredomain215180360DNAbindingHingeInducerbindingOligomerization图16-阻遏蛋白单体的结构和功能阻遏蛋白的结构域头段，-NH2端，lacO结合区绞链区核心段，-COOH，诱导物结合区4个亚基的核心片段接触形成四聚体对称轴，+11对称序列，6bp2.阻遏蛋白的结合位点－－lacO的结构诱导物和阻遏蛋白结合的模型维持阻遏过量的阻遏物可结合在DNA阻遏物结合在的其它位点操纵基因上aaaaaaaaa诱导物a诱导所有的阻遏物都结合aa在DNA的随机位点上aaaaa诱导物解离a建立阻遏阻遏物恢复活性状态aaa阻遏蛋白通过直接取代a从随机位点移向a操纵基因aaaaaa图16-14在细胞中所有的阻遏蛋白都结合在DNA上(仿B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997,Fig.12.18)阻遏能发生在多个位点上aroHGCCGAATGTACTAGAGAACTAGTGCATTAGCTTATTTTTTTGTTATCATGCTAAmRNAtrpAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAmRNAtrpRTGCTATCGTACTCTTTAGCGAGTACAACCmRNA操纵区域13图16-16trp阻遏物识别三个位点上的操纵区(仿B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997,Fig.12.19)199F3阻遏蛋白对RNApol功能的影响•阻遏蛋白和RNApol可同时与DNA结合RNApol与启动子结合的平衡常数1.9×107有阻遏蛋白时,2.5×109•结合着的RNApol不能转录.但加入诱导物后,释放出阻遏蛋白,变为开放型启动子复合物.•阻遏蛋白实际上使RNApol贮存在启动子上。这一模式是否存在于其它操纵元系统中？5.2.5乳糖操纵子调控模型主要内容：①Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码②这个mRNA分子的启动子紧接着O区，而位于I与O之间的启动子区（P），不能单独起动合成β-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。③操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。RNA聚合酶结合部位阻遏物结合部位操纵位点的回文序列④当阻遏物与操纵基因结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制。阻遏蛋白的负性调节没有乳糖存在时AYZOPImRNA阻遏蛋白RNApol⑤诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lacmRNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。有乳糖存在时AYZOPI阻遏蛋白mRNAβ－半乳糖苷酶乳糖半乳糖RNApol2.2操纵子突变－操纵子的发现（1）Oc操纵基因的组成型突变(顺式显性)顺式显性突变（cis-domin