第五章生物技术.

第五章单倍体细胞培养第五章第一节单倍体及其应用价值第二节离体花粉/小孢子发育途径第三节花药培养与花粉培养第四节植物单倍体育种本章主要内容第四章本章教学目的与要求•概念：花粉培养，花药培养，花粉二型性•单倍体的应用价值•离体花粉的发育途径•花粉培养与花药培养的比较•影响花药培养的因素第四章第一节单倍体及其应用价值•一、概念•二、单倍体的起源•三、单倍体植物的特点及遗传行为•四、单倍体的应用价值第五章一、概念单倍体是指具有配子染色体数的个体或组织，体细胞染色体数为n单倍体细胞培养主要包括三个方面：花药培养花粉培养未受精子房及卵细胞培养第一节二、单倍体的起源①种间和属间杂交远缘杂交中，异种植物虽然不能与母本授粉、受精，由于远缘花粉的诱导作用，卵细胞在没有受精的情况下受刺激而发育成胚土豆、大麦、小麦、玉米②物理照射和化学诱变花粉用射线照射后失去了受精能力，然后与母株授粉，卵细胞在花粉的刺激作用下进行孤雌发育，从而产生单倍体烟草、小麦、金鱼草第一节③双生苗的筛选（selectionoftwins）有些植物可产生多胚种子，即两个或多个胚被共同的种皮包裹着，这些种子可产生单倍体-单倍体、二倍体-二倍体和单倍体-二倍体植株在辣椒中，双生苗的频率受母本基因型控制通过筛选可以提高双生苗的频率④花药和花粉培养第一节三、单倍体植物的特点及遗传行为1、单倍体分成两类:一倍单倍体（monohaploids），这类单倍体起源于二倍体物种多倍单倍体（polyhaploids），这类单倍体起源于多倍体（如4X，6X等）第一节diploid植物其haploid即为monoploid玉米2n=2x=20n=x=10水稻2n=2x=24n=x=12柑橘2n=2x=18n=x=9tetraploid植物其haploid为dihaploid马铃薯2n=4x=48n=2x=24陆地棉2n=4x=52n=2x=26hexaploid植物其haploid为triploid普通小麦2n=6x=42n=3x=21octoploid植物其haploid为tetraploid草莓2n=8x=56n=4x=28第一节2、单倍体植物的特点•体细胞染色体数减半；•生长发育弱，体形小、各器官明显减小；•雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代第一节3、单倍体的遗传行为•一倍的单倍体只有一个染色体基数（X），减数分裂时染色体不能配对，分离极不正常•但具有一定同源关系的染色体可以部分配对，从而可以对染色体的演化过程进行研究四、单倍体的应用价值母本×父本F1F2花药培养花粉植株加倍选择鉴定品系比较试验区域试验品种5—8代（一）、缩短育种周期第一节（二）、提高目标基因型的选择效率•如果某一性状受一对基因控制–AA×aa→F1→F2中纯合AA个体只有1/4–F1采用花药或花粉培养，产生的后代中AA个体占1/2，比常规杂交育种提高一倍•如属两对基因控制–AAbb×aaBB,F2中要选出AABB个体的机率只有1/16–F1采用花药或花粉培养，AaBb只产生4种花粉：AB、Ab、aB、ab，加倍后AABB个体的频率可达1/4–比常规杂交育种效率提高4倍•常规育种：单倍体育种=1/22n：1/2n。第一节（三）、排除杂种优势对后代选择的干扰•对于杂交育种来讲，由于低世代很多基因位点尚处于杂合状态，会有不同程度的杂种优势表现，对个体的选择会造成一定误差•采用DH群体进行选择育种，由于各基因位点在理论上均处于纯合状态，选择到的变异能更大程度上代表真实变异第一节（四）、遗传研究的良好实验材料体系•单倍体在作物的数量遗传研究中可能有较大用途，如：基因相互作用的检测、遗传变异的估计、连锁群的检测、影响数量性状的基因数目的估计及多基因的定位等•DH系是分子标记遗传作图的良好群体•单倍体可用来创造非整倍体材料，用单倍体与二倍体杂交，可创造一系列的附加系，从而研究染色体的遗传功能•花药和花粉培养体系还是发育遗传研究的良好材料，可以用来研究细胞的分裂及分化，研究花粉发育途径的转变，以及与转变有关的基因的表达与调控第一节（五）、突变体的筛选•单倍体的每个基因都是单拷贝的，各种隐性基因都可以表现出来，加倍后形成的双单倍体各基因均处于纯合状态，突变体很容易表现出来，大大提高了抗性或其它突变体的筛选效率•对花药进行离子照射，然后对花药愈伤筛选，可以获得理想的突变体第一节（六）、消除致死基因•单倍体带有致死基因的个体即使加倍后形成双单倍体也会由于基因的纯合而被消除•而致死基因在自然群体里常常因为杂合体的存在而不易被彻底消除。（七）、选育新型自交系•对双亲或多亲杂交的杂种一代进行花药或花粉培养，获得的双单倍体实际上是纯合的自交系，在杂种优势利用育种中有很大用途第一节（八）、遗传转化的受体材料•在转基因育种中，如果用体细胞为受体，经常遇到转基因后代材料分离问题，经多代选择才能稳定下来•如用单倍体细胞作受体，获得的转基因材料经加倍后，从理论上讲会很快达到纯合状态•受体材料可以是花粉、单倍体原生质体、单倍体胚或单倍体植株作外植体第一节本节完第二节离体花粉/小孢子发育途径•一、花粉/小孢子的正常发育阶段•二、离体小孢子的发育途径•三、雄核发育启动机理第二节一、花粉/小孢子的正常发育阶段（一）、花粉不均等分裂途径(A途径)小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞。（1）A-V途径（营养细胞发育途径）由营养细胞重复分裂形成单倍体（2）A-G途径（生殖细胞发育途径）由生殖细胞重复分裂形成单倍体（3）E途径(营养细胞和生殖细胞并进发育途径）由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体（4）C途径营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株二、离体小孢子的发育途径第二节第二节（二）花粉均等分裂途径（B途径）小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞继续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株1、雄核发育与P花粉的形成花粉的二型性：在花药/花粉培养时，由于对培养条件的反应不同，花粉在形态上形成两种类型，一类是具胚性的，在烟草和大麦中，花粉小，染色浅；另一类为花粉大，染色深，朝成熟花粉方向发展P-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）三、雄核发育启动机理第二节在烟草和大麦中，花粉小，染色浅，为胚性的胚性小孢子第三节水稻花粉二型性在水稻中，胚性小孢子（约10%）比非胚性小孢子大、高度液泡化胚性小孢子第三节2、逆境处理与雄核发育的诱导热激处理物理或化学处理低温处理营养饥饿处理重金属胁迫激发花粉产生原胚促使细胞同步分裂改变细胞分裂周期第二节本节完第三节花药培养与花粉培养•一、花药培养操作技术•二、花粉培养操作技术•三、单倍体植株再生、鉴定及加倍•四、花粉培养与花药培养的比较•五、影响花药培养的因素•六、禾本科植物花药培养中的白化苗现象第三节花药培养:是植物雄性生殖器官-花药为外植体离体培养技术，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。也称为小孢子培养(microsporeculture)一、花药培养操作技术1、取材镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。2、消毒70％酒精浸泡30-60s花蕾后在1％次氯酸钠溶液中浸泡10-20min，无菌水冲洗3-5次。3、培养固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。第三节二、花粉培养操作技术(一)花粉的分离与纯化1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2、挤压法在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。3、机械游离（1）磁搅拌法：用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；（2）超速旋切法：通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。4、小孢子纯化对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子第三节(二)花粉培养方式1、平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养：花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养：花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。4、看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养6、条件培养基培养：利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。第三节看护培养：第三节（一）花粉植株的形态发生方式1、器官发生型花粉-----多细胞花粉粒----细胞团（愈伤组织）-----继代培养-----单倍体植株。2、胚状体发生型花粉-----多细胞花粉粒----进一步培养----胚壮体-----释放-----植物体。第三节三、单倍体植株再生、鉴定及加倍第三节（二）、单倍体植株鉴定1、染色体直接计数法：通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。2、间接鉴定（1）流式细胞仪鉴定：主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）细胞形态学鉴定法：叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。第三节（3）植株形态学鉴定法：单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。（4）杂交鉴定法：自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。（5）分子标记鉴定如RFLP、RAPD、AFLP等第三节（三）、染色体加倍1.茎段培养：将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。2.化学试剂诱变：秋水仙素诱导（1）浸泡法：无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养。（2）生长锥处理：秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。（3）培养基处理：将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚状体。第三节花药和花粉培养基本流程：预处理花药（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株。选择合适的供体植株（F1）倍性鉴定或染色体加倍第三节四、花粉培养与花药培养的比较第三节花药培养有时会由于花药中的有害物质而不能诱导小孢子启动第一次分裂，小孢子培养则不会花粉已是单倍体细胞，诱发都是单倍体植株或双单倍体，不含有因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成的体细胞植株花粉培养获得的材料总是纯合的由于花粉能均匀地接触化学的和物理的诱变因素，花粉是研究吸收、转化和诱变的理想材料可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程，是遗传与发育研究良好的材料体系1.供体植株的生长条件烟草：短光周期（8h）和高光强（16000lux）大麦：低温（12℃）和高光强（20000lux）油菜：高光强和一定的温度变化2.供体植株的年龄多数情况下幼年植株优于老年植株第三节五、影响花药培养的因素3.花粉发育时期花粉发育时期对诱导雄核发育非常重要一般从单核早期到双核早期第三节发育时期物种减数分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄单核早中期大麦、天仙子、马铃薯单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期烟草单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝花粉发育时期的确定•花药在接种以前，一般需先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗大小、颜色等特征之间的相应关系•根据花蕾和花药的长度判断小孢子发育时期，从而为取材提供参考第三节单核晚期第一次有丝分裂后期双核早