苹果茎痘病毒RT-PCR检测体系的建立

河北农业大学本科毕业论文第1页共17页苹果茎痘病毒RT-PCR检测体系的建立学生：钟敏指导教师：王亚南（河北农业大学植物保护学院河北保定071000）摘要：苹果为世界四大水果之一，河北省是我国渤海湾苹果产区的重要省份之一，苹果种植面积位居全省果品面积首位。苹果病毒病是苹果生产的大敌，目前，河北省苹果病毒病的发生情况还不清楚，而且由于苹果组织中含多糖多酚、苹果病毒含量低，苹果病毒检测体系还不成熟。本研究针对以上问题，对苹果茎痘病毒（Applestempittingvirus，ASPV）扩增引物进行筛选并对RT-PCR检测体系及程序进行优化。结果表明：ASPV(Z)、ASPV(Xin)、2002ASPV、ASPV(Y)几对扩增引物中，2002ASPV能检测出特异性条带且灵敏度高，适合田间检测；通过优化RT-PCR体系得出，在25µL总体系中，最佳cDNA模板量为0.25µL、3’与5’端引物1.0pmol、dNTPs2.5µL；通过对PCR程序的优化得出，rTaqDNA聚合酶最适用量为1.50U、循环次数35个循环、最适退火温度为57.6℃。最后通过对RT-PCR产物进行测序，确定扩增条带与目的片段DNA序列相似性高，与已发表的序列相似性达82%-90%。关键词：苹果茎痘病毒；引物筛选；RT-PCR优化EstablishmentofRT-PCRdetectionsystemforApplestempittingvirusCandidate：ZHONGMinAdvisor：WANGYa-nan(Collegeofplantprotection,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding,Hebei071001,China)Abstract：Appleisoneoftheimportantfruitsintheworld'.HebeiprovinceisoneoftheimportantapplesplantingareainChinaBohaiBayregion.ApplevirusdiseaseistheenemyofappleproductioninHebeiprovince.Atpresent,theinfectionofapplevirusisnotclear,butduetotheappleorganizationcontainingpolysaccharide,thevirusofapplecontentislowandapplevirusdetectionsystemisnotmature.ThisstudyaimingattheaboveproblemstoselectprimersofApplestempittingvirusandoptimizeRT-PCRsystemandprogram.Theresultsshowedthat,intheprimersofASPV(Z),ASPV(Xin),2002ASPV,ASPV(Y),the2002ASPVcoulddetectspecificfragmentwithhighsensitivityandwhichissuitableforfield.detection;TheresultofRT-PCRsystemcomponentoptimizingwasasfollows:cDNAtemplatewas0.25µL,3'and5'primers1.0pmol,dNTP2.5mM,whichcouldshowthebrightestandspecificfragment;ThePCRprogramisoptimized,theresultwasrTaq2.50U,cyclenumber35.Themostsuitableannealingtemperaturewas57.6℃;TheRT-PCRproductsweresequenced,thefragmentsizeconsistentwithpublishedDNAsequencewith82%-90%similaritytothepublishedASPVsequence.Keywords:ASPV;Primersscreening;RT-PCRoptimization河北农业大学本科毕业论文第2页共17页目录1.引言................................................................................31.1我国苹果病毒病种类及分布........................................................31.2苹果病毒检测技术研究进展.........................................................31.3研究的目的及意义.................................................................42材料与方法...........................................................................42.1试验材料.........................................................................52.1.1毒源材料.....................................................................52.1.2引物设计.....................................................................52.1.3主要试剂及仪器...............................................................52.2试验方法：.......................................................................52.2.1苹果病毒病样品总RNA提取方法................................................52.2.2.苹果茎痘病毒扩增引物的筛选.................................................72.2.3PCR体系的建立...............................................................82.2.4反应产物的电泳检测...........................................................93结果与分析...........................................................................93.1RNA质量检测……………………………………………………………………………………………93.2RT-PCR内标检测………………………………………………………………………………………103.3苹果茎痘病毒扩增引物筛..........................................................103.4PCR体系的建立..................................................................113.4.1PCR体系配置................................................................113.4.2PCR条件的优化..............................................................123.5RT-PCR的产物的测序…………………………………………………………………………………133.6田间检测........................................................................134讨论...............................................................................144.1苹果病毒病的危害特点：..........................................................14河北农业大学本科毕业论文第3页共17页4.2存在问题、最佳防治方法..........................................................144.3RNA提取和病毒扩增引物筛选及RT-PCR检测方法的优化中存在的问题...................144.4展望...........................................................................15致谢...............................................................................171.引言苹果为世界四大水果之一，分布广泛，具有很高的经济价值[l]。我国是世界果树起源中心，我国拥有世界最好的适宜产区，国内消费和扩大出口潜力巨大。我国苹果主要产区包括渤海湾产区、黄河故道和秦岭北麓产区和西北、西南高地产区。河北省是渤海湾苹果产区的重要省份之一[1]，2007年全国苹果种植面积为1961.8千公顷，河北省为250千公顷。河北省苹果种植面积位居全省果品面积首位[2]。苹果病毒病是苹果生产的大敌，苹果感染病毒后会严重影响果树的生长，降低产量、品质、果品的贮藏性和耐运力，也影响苹果根系对土壤营养物质的吸收和利用[3]。苹果病毒根据危害特点分为非潜隐病毒（Non-Latentvirus）和潜隐病毒（Latentvirus）两大类。目前世界上报道的苹果病毒病有39种，其中非潜隐性病毒25种，潜隐性病毒14种[4]。国外自本世纪40年代开展了对苹果病毒病的研究，目前国外主要苹果生产国基本上实现了苹果的无毒化栽培。我国对苹果病毒病的研究起步较晚，1978年从国外引进病毒指示植物才开始对苹果病毒病进行系统研究，目前已鉴定明确了我国苹果主产区病毒病的种类、分布，并在病毒检测方面取得了很大进展。1.1我国苹果病毒病种类及分布我国苹果病毒病已鉴定明确的苹果病毒17种，主要发生的有6种，分别为：苹果花叶病毒（Applemosaicvirus，ApMV）、苹果锈果类病毒（Applescarskinviroid，ASSVd）、苹果绿皱果病毒（Applegreencrinklevirus，AgrCV）、苹果褪绿叶斑病毒（Applechloroticleafspotvirus，ACLSV）、苹果茎痘病毒（Applestempittingvirus，ASPV）和苹果茎沟病毒（Applestemgroovingvirus，ASGV），前三种属非潜隐性病毒，后三种为潜隐性病毒[5]。苹果花叶病和苹果锈果病在全国各苹果产区均有发生；苹果绿皱果病仅在河南、甘肃、陕西、辽宁等地有报道；苹果潜隐性病毒发生普遍，国内目前的苹果主栽品及砧木普遍带有病毒，带毒率一般为60%-80%，有些品种如金冠、红星等品种的带毒株率几乎达100%，且多为复合侵染，复合侵染率为60%-100%[2]。1.2苹果病毒检测技术研究进展在当今技术水平下，苹果病毒病尚无有效的防治药剂。采用脱毒方法，繁殖无病毒苗木，加强病毒检疫，是防治病毒病的唯一途径，我国对苹果病毒病的系统研究起步