第五章酶工程-2.

第五章酶工程酶工程概况一、酶工程定义二、发展概况三、酶工程的技术范围四、酶工程的应用领域一、酶工程定义酶是由细胞所产生具有催化能力的蛋白质。它具有以下四个特点：专一性强、催化效率高反应条件温和反应产物易纯化反应产物污染小、能耗低和反应易控制一、酶工程定义酶工程的定义：利用酶催化的作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品，它是酶学理论与化工技术相结合而形成的一种新技术，也是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器的特定功能，借助于工程学手段来为我们提供产品的一门科学。优点：快速；高效；产品回收和提纯工艺简便。二、酶工程发展概况四个过程1.自然酶的开发和应用2.固定化酶和固定化细胞3.多酶发应器4.仿生技术自然酶的开发和应用从动物、植物或微生物细胞和组织中提取酶并加以利用的阶段。1894年，日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得了淀粉酶，用作消化剂1908年，德国的罗姆(Rohm)制得胰酶，用于皮革的软化1908年，法国的波伊登(Boidin)制得细菌淀粉酶，用于于纺织品的退浆1911年，美国的华勒斯坦(Wallerstein)制得木瓜蛋白酶，用于除去啤酒中蛋白质浑浊自然酶的开发和应用大规模生产阶段1949年，用液体深层培养法进行细菌a-淀粉酶的发酵生产50年代以后，酶制剂的生产转向微生物液体深层发酵的方法1960年，法国的雅各(Jacob)和莫诺德(Monod)提出了操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制固定化酶和固定化细胞固定化酶阶段酶的不足之处：酶的稳定性差；只能使用一次1916年，美国的奈尔森(Nelson)和格里芬(Griffin)发现吸附在骨炭上的酶仍具有催化活性1953年，德国的格鲁布霍费(Grubhofer)和施来斯(Schleith)首先将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与重氮化聚氨基苯乙烯树脂结合，制成固定化酶1969年，日本的千畑一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸固定化酶和固定化细胞固定化细胞阶段固定化菌体(固定化死细胞)技术(70年代初)1973年，日本在工业上成功的利用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸固定化细胞(固定化活细胞或固定化增殖细胞技术(70年代末)1978年，日本的铃木等人用固定化细胞生产a-淀粉酶研究成功固定化原生质体技术(80年代中期)1986年开始，用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、谷氨酸脱氢酶等的研究相继取得成功多酶反应器酶反应器：以酶作为催化剂进行反应所需的设备多酶反应器：多种酶固定化后，制成多酶反应器，模拟微生物细胞的多酶系统，进行多种酶的顺序反应，来合成各种产物此技术还处于实验室研究阶段仿生技术定义：模仿生物系统的原理以建造技术系统，或者使人造技术系统具有生物系统特征或类似特征的技术。如:模拟酶根据酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物。三、酶工程的技术范围1.各类自然酶的开发和生产2.酶的分离、纯化及鉴定技术3.固定化技术4.多酶反应器的研制和应用5.酶的修饰与改造四、酶的主要应用领域食品工业：佐料、香味剂等食品组分的生产及改良外观颜色和营养价值去污剂：碱性丝氨酸蛋白酶，这类酶的特点：在PH9.0~10.5是稳定且有活性在55～100°C范围是耐热的可与过硼酸盐、表面活性剂、鳌合剂等共存如加酶洗衣粉医学领域：助消化，如多酶片抗肿瘤或抗菌试剂，如半合成青霉素血液凝块的处理分析应用：诊断领域监测各种工业过程杀虫剂的分析化学药物的生产：通过固定化酶或固定化细胞完成废物处理：降解正常的底物：碳水化合物、蛋白质、脂肪和油将废物“再循环”，以便再利用纤维素的回收和利用酶底物用途氨基酰化酶L-氨基酸L-氨基酸的生产A-淀粉酶淀粉纺织品防缩，牙科消毒葡聚糖酶葡聚糖牙科保健葡萄糖氧化酶葡聚糖牙科保健木瓜蛋白酶蛋白质牙科保健果胶酶果胶木材防腐，纺织纤维的浸湿青霉素酰胺酶青霉素抗菌素的合成蛋白酶蛋白质牙科保健，鞣制皮革，底片上银的回收其它应用主要内容第一节酶的发酵生产第二节酶的分离纯化第三节酶分子改造第四节生物催化剂的固定化第五节酶反应器第六节生物传感器第一节酶的发酵生产一、酶的来源二、优良产酶菌种的筛选三、基因工程菌(细胞)的构建四、微生物酶的发酵生产一、酶的来源一切生物体都可作为酶的来源酶的早期来源：动物脏器和植物种子主要来源：微生物一、酶的来源微生物作为酶源的优越性：1.容易得到所需的酶类2.容易获得高产菌株3.生长周期短4.生产成本低5.生产易管理二、优良产酶菌种的筛选菌种筛选的一般程序:1.样品的采集采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量2.菌种的分离培养基的确定、培养条件的确定。二、优良产酶菌种的筛选菌种筛选的一般程序:3.菌种的初筛(1)用简单的定性反应进行初筛；(2)在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。4.菌种的复筛初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。复筛。酶活的测定方法的建立尤其重要。优良的产酶菌种应具备以下特点：(1)不是致病菌；(2)菌株不易变易和退化；(3)不易感染噬菌体；(4)微生物产酶量高；(5)酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞外酶；(6)产生的酶便于分离和提取，得率高；(7)微生物培养营养要求低。菌种筛选的一般程序:含菌样品的采集，菌种分离，产酶性能测定及复筛等。5.最佳产酶条件的初步确定(1)培养方式的确定；(2)最佳培养条件组合；(3)微生物产酶的特性(胞内酶、胞外酶)；(4)微生物酶收集的时间顺序；三、基因工程菌(细胞)的构建运用基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应性的微生物细胞之内，使其高效表达四、微生物酶的发酵生产培养基的选择发酵生产方式发酵条件控制提高酶的产量培养基的选择酶的合成受底物的诱导和分解代谢物的阻遏的双重调节作用，为提高酶产量，应向培养基中添加适量的诱导物，并尽量减少阻遏物的浓度。营养物质：碳源、氮源、无机盐、生长因子培养基的PH发酵生产方式固体发酵液体深层发酵发酵条件控制温度：产酶温度低于生长温度通气合搅拌pH的控制提高酶的产量添加诱导物：酶的作用底物、酶的反应产物、酶的底物类似物降低阻遏物浓度：添加难于利用的碳源；分批加碳源；控制末端产物的浓度表面活性剂添加产酶促进剂第二节酶的提取和分离技术酶的提取和分离技术是指从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所需酶的过程。内容包括：细胞破碎、酶的提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶。一、酶提取时注意的问题1.温度，尽可能在低温下（0-4度）进行。2.PH值，以缓冲液做溶剂，维持酶的稳定性和溶解度。3.盐浓度，盐溶和盐析。4.搅拌，避免剧烈搅拌和产生泡沫。5.微生物污染二、细胞破碎由于除了胞外酶之外，大多数酶存在细胞内部，为得到细胞内部的酶，首先要收集细胞、破碎细胞，让酶从细胞内释放出来，然后进行酶的提取和分离纯化。方法有：1、机械破碎法2、物理破碎法3、酶促破碎法4、化学破碎法三、酶的提取•酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶液或溶剂处理含酶原料，使酶溶解到溶剂中来，实际上是酶的抽取过程。方法有：•1、酸溶液提取•2、碱溶液提取•3、盐溶液提取•4、有机溶剂提取•各种方法详见表5-2。为提高酶的提取效率并防止酶的变性失活，在提取过程中要注意控制温度、PH值等提取条件。四、沉淀分离•沉淀分离是通过改变某些条件或添加某些物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出而与其他溶质分离的技术过程。方法有：•1、盐析沉淀法•2、等电点沉淀法•3、有机溶剂沉淀法•4、复合沉淀法•方法及原理详见表5-3五、离心分离•离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使大小不同、密度不同的物质分离的技术过程。方法有：•1、低速离心(8000r/min)，离心酶的结晶等较大颗粒的分离•2、高速离心(1-2.5)*104r/min，主要用于细胞碎片和细胞器的分离•3、超速离心(2.5-4)*104r/min，主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子及细胞器等六、过滤与膜分离•过滤是借助于过滤介质将大小不同、形状不同的物质分离的技术过程。方法有：•1、粗滤2μm•2、微滤0.2-2μm•3、超滤20Å-2μm•4、反渗透20Å(埃米，光波长度和分子直径的常用计量单位)•看表5-4七、层析分离•层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数）的不同，使各组分以不同比例分配在两相中（固定相和流动相）。方法有：•1、吸附层析•2、分配层析•3、离子交换层析•4、凝胶层析•5、亲和层析•6、层析聚焦•具体方法看表5-5八、电泳分离方法有：•1、纸电泳•2、薄层电泳•3、薄膜电泳•4、凝胶电泳•5、自由电泳•6、等电聚焦电泳九、萃取分离•萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取中的两相一般为互不相溶的两个液相或其他液体。方法有：•1、有机溶剂萃取•2、双水相萃取•3、超临界萃取十、结晶•结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。方法有：•1、盐析结晶法•2、有机溶剂结晶法•3、透析平衡结晶法•4、等电点结晶法，原理与沉淀分离的原理类似十一、干燥•干燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分，以获得含水分较少的固体物质的过程。酶经干燥以后，可以提高酶的稳定性、利于产品保存、运输和使用。方法有：•1、真空干燥•2、冷冻干燥•3、喷雾干燥•4、气流干燥•5、吸附干燥十二、酶的纯度与酶活力酶的纯度可用酶的比活力来衡量，酶的比活力是以每毫克蛋白所具有的酶活力单位来表示。一般情况下，酶的比活力随酶纯度的提高而提高。五、酶制剂的保存酶的保存条件的选择必须有利于维护酶天然结构的稳定性，应注意：（1）温度一般在0~4℃。（2）缓冲液（3）氧防护（4）蛋白质的浓度与纯度第三节酶分子改造酶分子是具有完整的化学结构和空间结构的生物大分子。酶的结构决定了酶的性质和功能。当酶分子的结构发生改变时，将引起酶的性质和功能的改变。酶分子完整的空间结构给予了酶分子的生物催化功能，使其具有催化高效性、作用专一性和反应条件温和等特点。但也其相应的弱点。限制酶大规模应用的原因：1.细胞外稳定性差；2.偏离最佳PH值时，酶活性低；3.具有抗原性。改变酶特性有两种主要的方法：1.通过分子修饰的方法来改变以分离出来的天然酶的活性。2.通过基因工程方法改变编码酶分子的基因从而达到改造酶的目的。一、酶分子修饰酶分子修饰指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造改变酶的一些性质：提高酶活力、改进酶的稳定性、改变最适PH值或温度、提高反应效率、改变抗原性等。一、酶分子修饰酶分子常见的修饰方法有：1.金属离子置换修饰；2.大分子结合修饰；（1）通过修饰提高酶的活力（2）通过修饰增强酶的稳定性（3）消除酶蛋白的抗原性3.侧链基团修饰氨基修饰、羧基修饰、酚基修饰等二、生物酶工程主要包括三方面的内容：1.利用基因工程技术大量生产酶；2.修饰酶基因，生产遗传修饰的酶；3.设计出新酶基因，合成自然界从未有过的酶。第四节生物催化剂的固定化一、概念二、酶的固定化方法三、细胞固定化方法四、固定化酶(细胞)的性质五、固定化酶(细胞)的指标一、概念固定化技术：通过化学或物理方法将酶束缚在一定的区域内，将酶固定再进行催化的技术。固定化酶：固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶的特点优点：1.不溶于水，易于与产物分离；2.可反复使用；3.可连续化生产；4.稳定性好。缺点：固定化过程中往往会引起酶的失活二、酶的固定化方法1)吸附固定化2)包埋固定化3)共价固定化4)交联固定化5)微囊固定化6)热