第八章基因克隆

第八章基因克隆基因克隆（genecloning）或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。一个完整的基因克隆过程包括以下步骤：１、获得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因与载体在体外连接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重组子；５、重组子的扩增与／或表达。第一节重组DNA中常用的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等，一、限制性内切酶的定义、命名和分类限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制－修饰系统。分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。限制性核酸内切酶的命名。二、限制性核酸内切酶的作用特点1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称（即具有迥文结构）；2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端。4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboIⅠ和Sau3A。三、其它工具酶参考“分子克隆”（Sambrook,Jetal.molecularcloning）第二节载体－宿主系统一、概述载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。载体应具备以下条件：１、能在适当的宿主细胞中复制；２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。宿主细胞是基因克隆中重组DNA分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：１、对载体的复制和扩增没有严格的限制；２、不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；３、在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；４、重组缺陷型，不会产生体内重组；５、容易导入重组DNA分子；６、符合重组DNA操作的安全标准。二、质粒载体质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。作为载体的质粒一般具有以下特点：１、分子相对较小（３∽１０kb）；２、松驰型复制；３、具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入；４、具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子；５、质粒能携带的外源DNA片段一般较小（15kb）．三、λ噬菌体载体λ噬菌体是一种双链DNA噬菌体，基因组约为50kb+。线性λ噬菌体DNA分子的两端各有12碱基的互补单链序列，是天然的粘性末端，称为COS位点。λ噬菌体的生活周期：溶菌（裂解）生长时在平皿上形成清亮的噬菌斑；溶源性生长。λ噬菌体的基因组：左臂长约20kb,含噬菌体头、尾蛋白编码基因；中央片段长约12-24kb,对噬菌体为非必需区；右臂长约10kb,含λ噬菌体复制和溶菌相关蛋白的编码基因。所有λ噬菌体载体均为通过切除非必需的中央区，并增减某些限制性酶切位点和插入适当的筛选标记基因改造而成。已构建的λ噬菌体载体分为两类：１、置换型载体：有两个酶切位点或两组排列相反的多克隆位点，其间的DNA片段可被外源DNA置换。这类载体适于克隆5-20kb的外源基因片段，常用于构建基因组DNA文库。２、插入型载体：只有一个限制性内切酶位点或一组多克隆位点可供外源基因插入。这类载体允许插入5-7kb的外源DNA,适于构建cDNA文库。如λgt噬菌体载体。一般将噬菌体DNA在体外包装成病毒颗粒后再用于感染受体菌，这样能大大提高转染效率。四、Ｍ13丝状噬菌体载体Ｍ13基因组大小为6407bp，它是一种闭环的单链DNA分子，在感染细菌后呈双链复制型DNA。因此用作克隆载体的双链DNA可从细菌中分离得到。在细菌中，双链DNA复制100-200拷贝后就大量产生单链DNA,后者包装成子代噬菌体颗粒，分泌到细胞外，而不裂解细菌。在M13基因组中含507个核苷酸的非必需区，在这个区域插入外源DNA不会影响M13的繁殖和生存，现在使用的M13载体如M13Mp18等均为对此区域进行改造而获得。M13克隆的最大问题是不能插入较大的外源ＤＮＡ片段（一般1000bp）,但M13载体的优点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒中含有一条与克隆的模板DNA互补的单链，所以最适合于制备DNA测序时用的单链模板，另外也可用于制备单链特异性DNA探针。五、粘粒载体粘粒（柯斯质粒）是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNA的COS区(约20-数百bp)与质粒重组而成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复制，但不表达任何噬菌体的功能。粘粒的结构特点：１、含有抗药性标记和质粒复制起始位点；２、一个或多个单一限制酶切位点；３、带有λ噬菌体粘性末端；４、分子小（4-6kb）,可容纳大到40-50kb的外源DNA片段，因此适于构建真核生物基因组DNA文库。六、酵母人工染色体载体酵母人工染色体由酵母染色体的着丝粒(cen4)、自主复制序列(ARS1)和来自四膜虫的端粒(Tel)等功能性DNA序列组成。它可携带长达200-1000kb的DNA片段，因此在人基因组DNA大片段的克隆中非常有用，是染色体克隆排序的主要工具。用酵母人工染色体克隆DNA的过程与λ噬菌体相似，将DNA大片段与载体的两臂相联，然后将连接混合物转化进酵母细胞中，利用载体上的选择性标记进行筛选。第三节目的基因的获取一、通过建立基因文库分离靶基因基因文库包括两类：基因组文库和cDNA文库，两种文库的建库过程不同，产生的基因结构也不同，因此应用范围也不相同。（一）、基因组文库是含有某种生物体（或组织、细胞）全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。用λ噬菌体载体构建基因组文库的基本步骤：１、准备载体DNA(如置换型λ噬菌体载体)，用适当的限制酶消化并分离得到载体的左右两臂；２、纯化真核细胞高分子量DNA，并用适当的限制酶部分消化；３、分离适当大小的基因组DNA片段（20-24kb）；４、连接载体与外源ＤＮＡ；５、连接产物体外包装及感染；６、基因组文库的扩增。由于基因组文库包含了染色体的所有随机片段形成的重组DNA克隆，因此，利用适当的筛选方法，就可以从中找出携带所需目的基因片段的重组克隆。（二）、cDNA文库cDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA.以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库。从cDNA文库可以获得较完整的连续编码序列（不含内含子），便于表达成蛋白质。构建cDNA文库的主要步骤：１、mRNA分离；２、cDNA第一链合成；３、cDNA第二链合成；４、载体与cDNA的连接;５、噬菌体的包装及转染；６、cDNA文库的扩增和保存。二、化学合成法制备DNA片段主要用于一些小的DNA片段的合成。三、聚合酶链反应法扩增基因片段对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚合酶链反应（ＰＣＲ），以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目的基因片段。第四节DNA分子的体外连接DNA片段的体外连接是重组DNA技术的关键。DNA连接是由DNA连接酶催化完成的。一、DNA连接酶DNA连接酶催化两年双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA连接酶：T4DNA连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。T4DNA连接酶在分子克隆中主要用于：１、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；２、连接双链DNA分子间的平端；３、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。二、粘性末端连接如果载体和插入片段具有相同的粘性末端，则很容易用DNA连接酶连接成环状的重组DNA分子，但是要注意当载体和插入的两个末端均为同源的粘性末端时，连接后可能出现以下问题：１、载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用碱性磷酸酶将载体DNA5’-端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；２、插入片段可双向插入；３、插入片段可多拷贝插入。当DNA片段两端为非同源的粘性末端时，可实现定向克隆，这时的连接效率非常高，是重组方案中最有效、简捷的途径。三、平端连接平端连接的优点是可用T4连接酶连接任何DNA平端，这对不同DNA分子的连接十分有利。因为除了相同或不同限制酶酶切产生的平末端分子外，含3’-或5’-突出的粘性末端也可以被补齐或削平，实现平端连接。（一）、5’-突出粘性末端的补齐限制酶降解产生的5’-端突出的粘性末端，可用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段（klenow片段）补齐。（二）、3’-突出粘性末端的削平含3’-突出的粘性末端可用T4DNA聚合酶的3’→5’外切核酸酶活性补平。平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，因此需较多的T4DNA连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇（ＰＥＧ）可促进平端连接反应。四、人工接头连接对平端DNA片段，可借助人工合成的接头来方便连接。所谓接头是人工合成的至少８个核苷酸长的一段迥文序列。接头是平端，在磷酸化后通过T4DNA连接酶可与大多数平端DNA连接。连接后用相应的限制性内切酶切割，可产生所需要的粘性末端。五、利用适配子连接适配子是人工合成的具有一个以上限制酶识别位点的短序列，它具有一个平端，可与其它DNA的平端连接，同时它还有某种限制酶的突出端，可与含互补的限制酶突出端的DNA片段连接，连接后，用适当的限制酶切割又可产生所需要的突出粘端。第五节重组DNA导入宿主菌体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质，将重组DNA分子导入受体可有不同的方法。一、转化指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态－即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。二、转染和感染利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。第六节重组克隆的筛选与鉴定基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。一、抗药性标志的筛选如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetrr，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。二、β－半乳糖苷酶系统筛选很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽，载体转化的宿主细胞为lacZΔ15基因型，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链，当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal变为兰色化合物，这就是所谓的α－互补，而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌