第八章荧光免疫技术

临床医学检验主管技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》第1页第八章荧光免疫技术第一节概述一、荧光的基本知识1、荧光荧光就是某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。2、发射光谱发射光谱是指固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光强度。激发态电子回到的能级不同，发出的荧光波长就不同。3、激发光谱激发光谱是指固定检测发射光波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。4、荧光效率荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率称为荧光效率。在一定范围内，荧光强度与激发光强度呈正相关，即激发光越强，荧光越强，但过强的激发光会使荧光很快褪去。荧光效率=发射荧光的光量子数（荧光强度）/吸收光的光量子数（激发光强度）。5、荧光寿命荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间称为荧光寿命。激发光消失，荧光现象随之消失，但各种荧光物质的荧光寿命不同，可利用延时测定的方法消除某些短寿命荧光的干扰，此为时间分辨荧光免疫测定的理论基础。6、荧光淬灭荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、苯胺、酚、Ⅰ-、硝基苯等）作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。7、荧光偏振P=FH-FL／FH+FL式中：P表示偏振度,FH表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度，FL是上述两者方向互相垂直时测得的荧光强度。当P=0时，说明完全不偏振；P在-1～+1之间即为部分偏振。二、荧光物质（一）荧光色素能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物称为免疫荧光色素或荧光染料。1、异硫氰酸荧光素（FITC）黄绿色荧光为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或乙醇等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感；②通常切片标本中的绿色荧光少于红色荧光。2、四乙基罗丹明（RB200）橘红色荧光为橘红色粉末，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。3、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）橙红色荧光最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。4、藻红蛋白（R-RE）橙色荧光本品为无定形，褐红色粉末，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸引光波长为565nm，最大发射光波长为578nm，呈明亮的橙色荧光。与FITC的翠临床医学检验主管技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》第2页绿色荧光对比鲜明，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。（二）其他荧光物质1、镧系螯合物其中以Eu3＋应用最广。Eu3＋螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。2、酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。第二节荧光抗体技术一、荧光抗体的制备荧光抗体技术是以荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定，此技术亦称荧光免疫组织化学技术。（一）抗体要求将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。用于标记的抗体应该具有高特异性和高亲和力。（二）荧光素要求实验室最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素。作为标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除；②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质；⑤标记方法简单、安全无毒；⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。（三）抗体的荧光素标记1、搅拌法此法适用于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短，荧光素用量少。但本法的影响因素多，若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色。2、透析法适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含FITC的0.01mol／LpH9.4的碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再对PBS透析法去除游离色素。低速离心，取上清液。（四）荧光素标记抗体的纯化1、透析法2、层析法（五）荧光素标记抗体的鉴定1、荧光素与蛋白质的结合比率结合的荧光抗体，并不是均一的，有的过量结合，有的未结合。过量结合者是非特异荧光着色的来源之一，而未结合者有抑制特异性荧光抗体反应的作用。2、抗体效价荧光抗体制备完成后应对其活性加以鉴定。可以采用双向免疫扩散试验测定抗体效价，抗原含量为1g／L时，抗体效价＞1：16者较为理想。3、抗体特异性①吸收试验：向荧光抗体中加入过量相应抗原反应后，再用于阳性标本染色，应不出现明显荧光。②抑制试验：阳性标本先与相应未标记抗体反应，洗涤后，再加荧光抗体染色，应受到明显抑制。（六）荧光抗体的保存临床医学检验主管技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》第3页荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光淬灭。最好小量分装，－20℃冻存可保存2～3年。真空干燥后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存，在4℃可保存1～3天。二、标本的制作常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。三、荧光抗体染色与结果判断（一）直接法特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。（二）间接法可用于检测抗原和抗体。本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。（三）双标记法用FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。（四）荧光抗体染色结果判断四、荧光显微镜的基本结构（一）光源通常用高压汞灯、氛灯或卤素灯作为激发光源。（二）滤光片滤光片分为隔热滤光片、激发滤光片和吸收滤光片。（三）光路（四）聚光器（五）镜头第三节荧光免疫分析的类型荧光免疫技术包括了荧光抗体技术和荧光免疫测定分析技术。荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。一、时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非放射性核素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。（一）基本原理1、时间分辨2、Stokes位移激发光谱和发射光谱的波长差。临床医学检验主管技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》第4页镧系元素的荧光光谱Stokes位移较大，为273nm，很容易利用简单的滤光片进行波长分辨，把激发光和发射光分开，消除激发光的散射（由样品池、溶剂分子和溶液中胶体颗粒引起）干扰。3、发射光谱和激发光谱镧系元素发射光谱带较窄，有效地降低了本底荧光。镧系元素激发光谱带较宽，为300～350nm，有利于增加激发能，提高灵敏度。4、荧光标志物的相对比活性比活性是指单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。5、信号增强镧系元素发射光谱带较窄，有效地降低了本底荧光。镧系元素激发光谱带较宽，为300～350nm，有利于增加激发能，提高灵敏度。（二）标志物和标记方法1、标志物用于时间分辨荧光免疫测定的标志物是镧系元素，最常用的是铕。2、标记方法镧系元素离子不能直接与抗原或抗体结合，需应用具有双功能基团的螯合剂，其一端与镧系元素离子结合，另一端与抗原或抗体蛋白分子上的氨基结合，形成镧系元素离子-螯合剂-抗原（或抗体）复合物。（三）方法类型1、双抗体夹心法2、固相抗体竞争法3、固相抗原竞争法（四）方法评价时间分辨荧光免疫测定灵敏度高；分析范围宽；标记结合物稳定，有效使用期长；测量快速，易自动化；无放射性污染，在灵敏度、稳定性和测量自动化程度等方面都可与放射免疫分析媲美，为目前超微量物质分析最有发展前途的一项技术。缺点是易受环境、试剂和容器中的镧系元素离子的污染，使本底增高。二、荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定是利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物的荧光偏振程度的差异，测定体液中小分子物质的含量。（一）基本原理当光线通过偏振滤光片后，形成只有一个方向的平面光,称之为偏振光。荧光物质经单一平面的偏振光（蓝光，485nm）激发后，可吸收光能并发射出相应的偏振荧光（绿光，525～550nm），偏振荧光有很强的方向性。荧光偏振免疫测定常用异硫氰酸荧光素（FITC）标记小分子抗原。（二）方法评价荧光偏振免疫测定样品用量少；荧光素标记结合物稳定，使用寿命长；方法重复性好；快速，易自动化；试剂盒专属性强，适于检测小分子和中等分子物质，不适宜测定大分子物质；灵敏度较非均相荧光免疫测定法低。三、荧光酶免疫测定荧光酶免疫测定是利用酶标抗原（或抗体）与待检抗原（或抗体）反应，借助酶反应荧光底物，经酶促反应生成稳定且高效的荧光物质，通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。临床医学检验主管技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》第5页（一）基本原理以碱性磷酸酶（ALP）标记抗体（或抗原），以固相载体包被抗原（或抗体），以4-甲基伞酮磷酸盐（4-MUP）为碱性磷酸酶反应的荧光底物，碱性磷酸酶分解4-MUP，脱磷酸根基团后形成4-甲基伞酮（4-MU）。4-MU经360nm激发光照射，发出450nm的荧光，通过荧光计数仪记录所产生的荧光强度，计算出待检抗原或抗体的含量。（二）酶和荧光底物用于荧光酶免疫测定标记的酶及荧光底物见表4-8-1，其中最常用的酶是碱性磷酸酶，最常用的荧光底物是4-甲基伞酮磷酸盐（4-MUP）。（三）方法类型1、双抗体夹心法2、双抗原夹心法3、固相抗原竞争法（四）方法评价荧光酶免疫测定由于使用酶和荧光底物的化学反应作为放大系统，故灵敏度大大提高。但血清和其他生物样品的背景荧光会干扰测定，因此用固相荧光酶免疫测定法效果好。第四节荧光免疫技术在医学检验中的应用一、荧光抗体技术的应用1、自身抗体检测2、病原体检测3、免疫病理检测4、细胞表面抗原和受体检测5、流式细胞术二、荧光免疫测定的应用时间分辨荧光免疫测定应用范围十分广泛，包括蛋白质、激素（肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等）、药物、肿瘤标志物、病原体抗原／抗体。荧光偏振免疫测定特别适用于血清或尿液中小分子物质的测定，目前已有数十种治疗药物和成瘾药物、维生素、激素及常规生化项目可用荧光偏振免疫测定进行分析和定量测定。荧光酶免疫测定可用于多种抗原抗体的检测，如病毒抗体、细菌及毒素抗原、激素、肿瘤标志物、过敏原、心肌损伤标志物和凝血因子。